外泌体在肝细胞癌发病中的研究进展*

闫冰冰 晁 旭 冯雪松 黄 峰△

1.陕西中医药大学 (陕西 咸阳， 712000) 2.陕西中医药大学基础医学院病理学教研室 3.陕西中医药大学基础医学院生物化学教研室

肝细胞癌(HCC)是世界上第三大常见的恶性肿瘤，占原发性肝癌的85%～90%[1]。HCC已发展成为全球范围内最具致命性、侵略性和恶性程度最高的癌症之一[2]。乙型肝炎病毒(HBV)感染被认为是中国HCC发病的主要危险因素[3]。虽然近年来研究出了新的HCC治疗方式，但只有根治性手术切除才有可能治愈早期HCC。对于中晚期HCC，虽然已经开发了如索拉非尼等药物来提高患者生存率，但是晚期肝癌患者的预后仍差，迄今为止尚无有效的治疗方法[4]。外泌体是可以在细胞间转运生物活性分子的膜结合囊泡，其大小约为40～100 nm[5]。通过多种生物分子调节细胞之间的微环境和免疫系统，不仅如此，这些外泌体还会通过“转运”方式在细胞内空间交换和传递遗传物质[6-8]。不仅如此，外泌体还参与肿瘤细胞的转移、血管生成与正常细胞向肿瘤细胞的转化。许多类型的细胞增加表明外泌体参与了肿瘤的发生、发展、转移、免疫逃逸和耐药性，其机理在于这些细胞如免疫细胞、间充质细胞和肿瘤细胞可能诱导了外泌体的释放[2]。此外，肿瘤来源的外泌体含有大量与癌症相关的血清学标志物，例如miRNA，可用于早期HCC的检测。迄今为止，外泌体生理功能的研究仍未完全明确，本文综述了外泌体的功能、结构及其对HCC的影响和临床应用。

1 外泌体的来源和功能

外泌体最初被认为是具有网织红细胞胞膜特征的红细胞成熟“废弃物”，有学者于1987年从绵羊网织红细胞中分离出的囊泡[9]。随着时间的推移，新的研究进展也逐渐证实了外泌体是通过将细胞膜与胞内多囊泡分离，然后释放到细胞外空间而形成的小的磷脂双层膜纳米囊泡[10]。外泌体可以被任何细胞如B淋巴细胞、T细胞、肥大细胞、树突状细胞等合成，并可能被分泌到其他细胞中以实现其功能[11]。外泌体的密度约为1.13～1.19 g/ml[12]。外泌体含有蛋白质、RNA、DNA、胆固醇等大小从50～140 nm不等的生物活性物质[2]。泪液、尿液、母乳、血浆和细胞培养上清液等生物液体中存在大量外泌体[9]。新兴证据表明，外泌体也可在肿瘤的生长过程中被分泌，例如，Yang等[13]研究表明长链非编码核糖核酸(lncRNA HOTAIR)可诱导MVBs将其转运至质膜，进一步促进HCC外泌体的释放。

2 外泌体在CHB向HCC转化过程中的作用

外泌体可以由一些星状细胞、肝细胞和免疫细胞的正常肝细胞所分泌，与此同时，这些细胞外囊泡介导肝细胞之间的正常信息交流，维持肝内环境平衡[2]。有研究发现，肝硬化期、HCC早期和晚期的浆液外泌体含量均显著高于正常肝、肝变性和肝纤维化，表明外泌体具有较高的能力可以运用于HCC的早期检测与诊断中[14]。Li等[2]表明，当细胞被病毒感染时，外泌体参与了扩散、免疫调节和抗病毒反应。在中国，HCC发生的主要原因是慢性乙型肝炎(CHB), Kouwaki等[15]研究表明HCC可诱导外泌体miRNA-21和miRNA-29，抑制树突状细胞和巨噬细胞，释放IL-12，而IL-12可激活自然杀伤细胞(NK)，从而破坏先天免疫应答。CHB的长期病史可能会带来肝纤维化的影响，在接受特定的刺激下，肝星状细胞(HSCs)会转变为肌成纤维细胞，这与HCC的发生和肝纤维化的发病机制有关[16]。Zhou等[17]发现外泌体可以利用miR-214相互作用于细胞穿梭，从而调节结缔组织生长因子2 (CCN2)的形成。随着肝纤维化的活化，外泌体在肝干细胞中过表达CCN2，几年后，肝纤维化将进展为HCC[2]。

3 外泌体与HCC的关系

随着研究的不断进展，越来越多的新兴证据也可以表明，外泌体在HCC的形成与转移过程中起着至关重要的作用，外泌体中的物质同样可以用于临床诊断和治疗。

3.1 外泌体调节HCC的生长和转移 外泌体可分泌miRNAs或其他物质，从而调节HCC的生长和转移。HCC细胞分泌的miRNA-21使HSC中PDK1/AKT信号激活，进而将HSC细胞转化为CAFs，活化的CAF分泌如基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子，将进一步促进癌症的发展[17]。此外，免疫细胞中的toll样受体(TLR)与含有miRNA-21和miR-29a的外泌体在结合的情况下，可激活TLR中的NF-κB通路，从而分泌一系列炎症因子，促进肿瘤的生长与转移[18]。Fang等[19]发现包含miR-1247-3p的外泌体会导致CAF激活β1-整合素-NF-κB信号通路，而这种外泌体由高转移性HCC细胞产生，最终CAF通过激活IL-6和IL-8进一步促进HCC的发展。Li等[20]在实验中首次发现lncRNA FAL1在HCC外泌体中上调，同时可以转移到其他HCC细胞中促进肝癌细胞的生长和迁移。除了HCC细胞，有些细胞同样也可以分泌外泌体，从而促进HCC生长并减少DNA损伤。例如，Zhang等[21]在其研究中证实脂肪细胞可以通过降低miR-34a并激活肿瘤生长中的USP7/Cyclin A2信号通路来释放外泌体环状RNA(circRNAs)，减少DNA损伤。

3.2 外泌体对HCC血管生成的影响 HCC具有高度血管生成性，VEGF在HCC的发病过程中发挥了重要作用。最近的一项研究表明，间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体通过下调VEGF抑制肿瘤血管生成，其是细胞间信息交流的重要介质[2]。Xue等[22]研究发现，由CD90+HCC分泌的外泌体可以在经过lncRNA H19的高表达后，上调VEGF及VEGF-R1的转录，从而诱导肿瘤血管生成。Lin等[23]发现HCC细胞分泌的外泌体中存在的miR-210，可以通过靶向SMAD4和STAT6转移到内皮细胞中，从而促进肿瘤血管生成。Yukawa等[24]发现HepG2外泌体表达NKG2D(一种免疫细胞的活化受体)和HSP70(一种与压力有关的热休克蛋白)，两者都作用于VEGF受体，引起肿瘤血管生成。Fang等[25]发现HCC分泌的外泌体中miR-103促进HCC转移，其是通过作用于内皮细胞增加血管通透性来完成的。Lee等[26]研究发现，随着真核翻译起始因子3亚基C(EIF3C)的表达，HCC细胞分泌外泌体的能力也逐渐增强，继而引起肿瘤生长，最终导致肿瘤血管生成。

3.3 外泌体参与HCC上皮-间质转化(EMT) 上皮-间质转化(EMT)主要是指上皮细胞间连接的破坏和极性的丧失，从而转化为具有间质表型的细胞[27]。对于HCC来说，EMT在其发生发展中起至关重要的作用，在EMT期间，上皮细胞被迫获得干性、侵袭性、向远处器官转移的能力以及耐药性的间质表型特征[28]。EMT在促进HCC的侵袭和转移中起着重要作用[29]。Tang等[30,31]提出了体外实验CTNND1促进细胞增殖、迁移和体外侵袭，并通过CTNND1在体内促进HCC细胞肿瘤形成和转移。根据更彻底的分析，与人肝癌标本中的β-catenin，WNT11，Cyclin D1和BMP7表达相比，CTNND1的表达具有强烈的关联性。他们还发现，CTNND1间接增强Wnt /β-catenin信号传导，从而促进HCC转移。

3.4 外泌体与HCC免疫调节的关系 利用免疫细胞靶向肿瘤是医学研究的一项热点。在Lu等[32]最近进行的一项研究中，富含AFP的外泌体引发了特异性的抗肿瘤免疫反应，为治疗HCC提供了一种新的无疫苗方法。Rao等[33]还报道了源自HCC抗原的外泌体相比细胞裂解物能引起更强的免疫应答。发现使用小鼠细胞来源的外泌体对HCC进行治疗时，肿瘤免疫微环境可有明显改善，例如T细胞和γ-IFN的水平增加，IL-10和TGF-β的水平下降。由此可以得出结论，由HCC抗原表达的肿瘤细胞外泌体可能会触发DC中强烈的免疫反应，从而改善HCC的免疫微环境。已有研究证明，巨噬细胞在通过经典激活途径刺激脂多糖(LPS)和γ干扰素(IFN-γ)后，可以分化为M1型，发挥促炎、抗肿瘤作用，或通过选择激活途径，经IL-4 刺激分化为 M2 型，发挥抗炎、促肿瘤作用。在HCC从早期发展到晚期的过程中，TAMs从M1表型转变为M2表型，目前认为TAMs以M2型为主，作为与HCC相关炎症的关键因子，它们通过释放如IL-8、IL-10、TGF-β等各类细胞因子，抑制有效的抗癌免疫、刺激血管生成和EMT来促进肿瘤生长和转移[34，35]。

3.5 外泌体在HCC诊断和预后中的应用 由于肿瘤的时间异质性和空间异质性，传统的组织标本活检方法已经无法获得肿瘤组织完整、动态的信息，“液体活检”技术克服了传统组织活检的缺点，由此应运而生。在磷脂双层膜的保护中，外泌体物质不能被任何酶降解，因此外泌体被认为是一种合适的诊断工具。由于外泌体具有许多可以由肿瘤细胞表达的独特物质，因此可以将它们用于肿瘤的早期检测。Pa等[36]收集了345例HCC、93例肝硬化、46例慢性肝炎和1 033位健康人的血清样本，通过使用miRNA微阵列分析，发现了其在Ⅰ期也能保持诊断的准确性，这说明血清中的miRNA可作为准确检测HCC的生物标志物。Li等[2]在研究中提到Won Sohn等发现HCC患者外泌体中miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224的水平低于HBV患者，表明这3种miRNA可以作为检测HCC的新的血清标志物。另一项研究还报道了miR-29b，miR-30d和miR-140在HCC患者的生存中具有重要意义，因此，这些对晚期HCC的治疗起指导作用的外泌体miRNA可以作为HCC的预后生物标志物[37]。Xu等[38]认为，血清外泌体RNAs ENSG00000258332.1和LINC00635联合血清AFP可能是诊断和预后HCC的有前途的方法。除miRNA外，越来越多的研究证实，lncRNA在许多肿瘤中都具有差异性表达，能够作为辅助肿瘤早期诊断的分子标志物,牛磺酸上调基因(TUG1) 是一种进化上高度保守的lnc RNA，Yu等[39]研究发现TUG1能够促进肝癌细胞的增殖能力，这表明TUG1对于肝癌细胞具有促癌作用。其他实验也支持外泌体lncRNA可作为HCC的预后因子，与正常的相比，lncRNA在HCC患者中显着上调，具有良好的稳定性和特异性[40]。除lncRNA外，circPTGR1在97 L和LM3细胞的外泌体中特别表达，并在HCC患者的血清外泌体中增加，Wang等[41]指出，它可以用于HCC的临床分期和预后。

3.6 外泌体在HCC治疗中的应用 HCC对普通化疗不敏感，miR-122可以增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性，外泌体作为一种具有低毒性、低免疫原性以及高生物相容性等特征的miRNAs的生物载体[42]。同时，MSC可以分泌大量的外泌体，研究人员发现，将miRNA-122转染到由MSC形成的脂肪来源的间充质干细胞中，可以产生含有miRNA-122的外分泌体，从而增强癌细胞对化疗的敏感性并改善miR-122靶基因的表达[43]。Wang等[44]发现，miR-335-5p可以由星状细胞衍生的外泌体装载，值得肯定的是miR-335-5p能够被引入肝癌细胞中抑制肿瘤生长和转移，从而为HCC提供了新的治疗策略。

4 结语与展望

外泌体对于HCC有重要作用，它参与了HCC的发生、发展和转移，为HCC的治疗提供了新的思路。不仅如此，外泌体中的许多物质都可以用作新的生物标志物，这对于改善HCC的早期诊断具有重要意义。随着医学界对外泌体研究的不断深入，外泌体成功应用于早期HCC的临床诊断与治疗将指日可待。