基于大肠杆菌O157:H7 快速检测技术的研究综述

贾亦琛，初浩展

（1.齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2.青岛科技大学，山东 青岛 266000）

1 大肠杆菌0157：H7与人类的关系

大肠杆菌（学名：Escherichia coli (T.Esc herich 1885)）是由Escherich 在1885 年发现的，绝大多数的大肠杆菌和人类都有着良好的合作关系，不仅可以竞争性抵御致病菌的攻击，还可以帮助人体合成维生素K。但仍有少数血清型为致病性的大肠杆菌存在于食物和人们的饮用水中，危害着人们的生活，尤其是对抵抗力尚不完善的儿童，危害很大。大肠杆菌O157:H7 就是其中一种，它致病性极强且能产生志贺样毒素从而引起人体的出血性肠炎，一旦感染主要表现有剧烈的腹痛和便血，严重的还会出现溶血性尿毒症甚至死亡[1]，所以这种能危及生命的致病菌已被食品卫生主管部门视为常规检测的项目。因此具有能快速检测病菌的技术，可以有效保证人们的食品安全问题，本文以此为背景对生鲜中的大肠杆菌O157:H7 的快速检测方法进行论述，为保证生鲜的质量，提高人们的食用安全提供思路。

2 现有的微生物检测技术

目前传统的细菌检测方法有直接的涂片观察，使用选择或鉴定培养基分离鉴定细菌，血清学鉴定和分子生物学鉴定的方法。平板培养法在各个领域都有着广泛的应用，细菌培养和生化鉴定的方法步骤简单而且费用低，可直接根据细菌的代谢特点，在培养基中加入指示剂，从而通过颜色变化直接鉴定细菌的种类。但是该方法耗时长、操作过于繁琐、灵敏性也相对较低[2-3]。正是由于传统的检测方法存在不足，越来越多的学者利用微流控芯片加载各种化学成分，对病原微生物的检测以及体外诊断进行研究。胡慧等[4]利用实时定量荧光快速检测法，对大肠杆菌0157:H7 的特异基因设计出一对特异的引物进行合成制作实时荧光检测PCR 检测模板，从而建立SYBR Green I 进行实时定量检测。该方法的建立能够特异、灵敏地对大肠杆菌O157:H7 做出检测，且是封闭式操作过程，大大减少了杂菌的污染；斯城燕等[5]通过一种基于表面存在的离子共振(surface plasmon resonance，SPR)，选用了BIACORE 3000 系统和葡聚糖加以修饰的CM5 芯片，经处理后用于大肠杆菌O157:H7 的检测，使检测更加准确、高效且操作简单；葛萃萃等[6]通过检测发现10mg/mL 纯化的抗大肠杆菌O157:H7lgY 抗体其效价为1:320，然后再通过免疫大白兔得到兔抗大肠杆菌抗体其效价达1:25600，再以兔抗大肠杆菌的抗体作稀释3000 倍处理作为一种捕获抗体，从而为检测抗体建立了双抗夹心ELISA 的方法；该方法具有较好的敏感性能和特异性。赵远洋等[7]发现该技术在链置换型DNA 聚合酶的作用下，对已有的目的基因的特异性进行高效的复制。王丽等[8]分别针对大肠杆菌O157:H7 的三个特异性基因rfbE，stx1 和stx2 的8 个靶区分别设计了内、外和环引物从而进行LAMP 扩增检测，该项技术通过Bst DNA 聚合酶在恒温条件下从而实现靶基因自循环链置换成合成反应，引物识别基因6 或者8 个独立的区域，同时与PCR 进行结果对比，其结果表现出比传统PCR 高10 倍以上的灵敏度及特异性，该实验方法的操作简便，具有较高的灵敏性和特异性，能快速地检测出细菌。

3 微流控芯片研究进展

微流控的加工最重要的是依托微电子技术，采用的是标准软刻蚀工艺，就是在玻璃的基板上旋涂光胶，从而来遮挡含有的微通道图形掩膜，再经过曝光和显影后才得到的模具。微流控芯片之间具有良好的电绝缘、散热和光学等特性，它可以携载生物大分子，对于检测信号的干扰非常的小，而且它的制作工艺也比较简单，成本低，装置也具有微型化、系统集成化和反应时间短等等特点。目前新型的微流控技术已经在核酸分离和定量分析等领域有广泛的应用，在蛋白质、多重PCR、LAMP、原位荧光等领域也有了一定成熟的检验技术，其基于免疫分析的原理主要是以抗原、抗体还有荧光靶目标为新型的标记物。

目前越来越多的实验者尝试使用3D 打印技术对微流控芯片进行加工和修饰，该技术使得微流控的发展更加快速，制作过程也更加简便。此前已有研究通过使用微流控芯片来实现DNA 的快速分离，通过在微流控芯片上加入各种化学反应，从而可应用于药物合成以及筛选，并且微流控技术已被国外许多医疗机构应用在体外诊断方面，并取得明显突破。还有科研人员通过PCR 的全自动分子诊断，发现了微流控芯片发展的巨大潜能和发展方向。在当今时代，器官芯片的研究也已成为一大热门，并在2016 年还入选了十大新兴科技之一，目前国内外都已研发出能使多种细胞组织体外共存的器官芯片[9]。

4 微流控技术在检测病原体方面的应用

利用微流控芯片可进行多种病原体和病毒的快速检测，在微流控的蛋白质免疫分析法当中，通过电渗流分离以及紫外分光光谱等检测技术，使待测样本在原先设定好的检测程序的芯片上自动完成检测，从而使整体的反应效率大大提高；通过生物的光信号学与适配体之间的相互作用的特性，大大缩短了检测的时间，这对于临床检测来说无疑是一大利处；以及广东医科大学先前所研发出的微流控芯片核酸分析系统、免疫化学发光分析系统等，可通过程序化的步骤完成细胞的裂解、核算的结合、磁珠的洗涤等一系列操作，该芯片可用于检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体等；关于负压驱动皮升级等温核酸精确定量实验中应用了新的芯片结构，其芯片中采用了氟硅烷纳米涂层，可有效地防止反应过程中水蒸气的流失，保证了目标分子的正常进行，从而精确定量目标分子，在进行微流控芯片制作时可使用该方法从而得到改进，使之能更快速简便地检测出大肠杆菌。由于芯片的操作简单及富有多样性，微通道可根据不同种类特点的病原进行针对性加强设计，这种技术已在病原体的检测领域得到高速的发展和广泛的应用。

但目前微流控芯片的发展仍然存在着不足：①相关研究人员的不足，导致其发展进程得不到快速提升；②微流控技术的产品不够成熟，缺乏配套的芯片驱动平台以及检测模块等相应的系统组件，由于技术的不太成熟导致产品缺少规范和标准化，无法实现组件的通用化；③存在一定的技术难题，目前抗体等生物分子可通过疏水吸附在疏水性的微管通道表面，但可导致抗体的构象发生改变从而导致活性、灵敏度降低，另外微流控芯片和外围设备的自动分析、设备显示的集成化也是需要攻克的难题。

5 微流控芯片的发展趋势和展望

5.1 趋势

微流控芯片是90 年代分析化学领域中逐渐发展起来的一种分析方法，它是以化学分析为基础，辅以微机电加工技术，再以网络管道加以修饰为结构特点，以生命科学为主要研究应用方向，其主要目标是把整个化学化验室的功能都集成在一块微小的芯片上，从而实现便捷、高效、重复利用等优势，使之更具有广泛的应用性和发展前景。随着微流控技术的广为人知以及其所具有的潜在发展前景，许多科研实验者已报道采用多相层流的技术去实现芯片对实验样品的无膜过滤、渗析和萃取分离等，也有学者通过微加工完成微流控质谱分析前试样前处理操作，以及将其制作成过滤器、检测细菌等应用产品。其特点是高效、自动化以及集成性高和便捷化，从而可大大降低珍贵试验样品的消耗，以及大大提高分析的速度，降低成本，能够普及到千家万户。

5.2 展望

近二十年来，研究人员提出过许多有关快速检测细菌的方法，比如基于免疫学、核酸以及生物传感器等等的方法，但这些方法都仍然存在着许多缺陷，无法满足临床及社会的需求。从目前发展前景来看，微流控芯片技术已经突破了原有的发展技术所遇到的难题，现在正在进入一个更深的研究层次，不断地扩大应用范围，挖掘更多可以应用的领域，以及更深度的产业化发展模式。相信在未来的几年，以微流控芯片为核心的技术将应用于更多的分析检测领域，为人们的生活提供更加便捷、高效健康的检测产品。