哮喘儿童IL-17A rs2275913基因多态性的临床意义

周进进，王 娟，李晓娜

(连云港市第一人民医院儿内科，江苏 连云港 222000)

儿童哮喘是常见的慢性呼吸道疾病，哮喘急性发作可突然发生胸闷、咳嗽、气促及喘息等症状，或原有症状急剧加重，并且常伴呼吸困难，以呼气流量下降为特征，常因呼吸道感染或接触刺激物、变应原诱发[1-2]。儿童是哮喘的高发人群，发病率达1.5%～7.45%，且呈逐年上升趋势[3]。白细胞介素(interleukin，IL)-17A是由辅助性T细胞(helper T cell，Th)17细胞分泌的细胞因子，其参与了体内炎症反应和免疫应答[4]。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1与气道重塑有关。免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合，使气管处于高敏状态，再次接触过敏原时，即可造成机体的过敏反应。本文研究了IL-17A rs2275913基因多态性与哮喘患儿TGF-β1和IgE表达水平的临床意义，以期为哮喘儿童的治疗提供资料，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取2018年6月至2020年6月连云港市第一人民医院收治的哮喘患儿45例为哮喘组，随机选取同时期健康体检儿童45例为对照组。对照组中男性27例(60.00%)，女性18例(40.00%)；年龄为1～5岁，平均年龄(4.21±1.06)岁。哮喘组中男性26例(57.78%)，女性19例(42.22%)，年龄为1～6岁，平均年龄(4.47±1.56)岁。本研究经我院伦理委员会审核批准，且两组儿童及家属均签订知情同意书。两组的一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①依据《儿童支气管哮喘诊断和防治指南》的诊断标准确诊的患儿[5]；②对照组儿童近期无感染、发热等，且无过敏史和鼻炎疾病史等过敏性疾病家族史；③哮喘组患儿近期未使用过激素类药物治疗。排除标准：①存在严重免疫功能缺陷；②入院前1个月内应用相关免疫抑制剂；③伴有先天性心脏病及呼吸道疾病；④伴其他系统严重器质性疾病。

1.3 方法

1.3.1脱氧核糖核酸的提取

采集两组儿童空腹外周静脉血2mL置于抗凝管中，以脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(上海生工生物有限公司)提取两组的IL-17A rs2275913基因DNA，提取引物分别为正向：5′-GCATAACTCTT-CTGGCAGCTGTA-3′，反向：5′-TGCCCACGGTCC-AGAAATAC-3′，引物延伸序列：5′-TTTTTCCCAA-TGAGGTCATAGAAGAATCTCT-3′(上海生工生物有限公司设计引物)。

1.3.2 IL-17A rs2275913基因多态性的检测

采用15μL DNA反应体系(2μL模板DNA、1.5μL Mg2+、1IUTaq DNA聚合酶、1.5μL 10×缓冲液(Buffer)、0.3μL脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)和1μL多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物，其余部分由双蒸水补充至15μL检测基因多态性。将上述试剂充分混匀，离心，置于PCR仪上进行扩增反应，反应程序：95℃预变性2min，在扩增阶段以95℃×3min、94℃×15s、55℃×15s、72℃×30s的程序完成35个循环。完成扩增后，取3μL的扩增产物，以0.2μL ExoI和0.8μL FastAPc纯化。取2μL PCR产物，加入1μL的多重分析试剂和1μL延伸产物，并加入双蒸水至6μL，将上述混合液以96℃×1min、96℃×10s、52℃×5s的程序完成30个循环，然后60℃×30s的程序进行延伸反应。取延伸产物1μL，加入10μL的Buffer，95℃变性3min，然后冰浴，在测序仪上测序。

1.3.3 IL-17A rs2275913基因分型

采用GenMapper 4.1进行IL-17A rs2275913基因单核苷酸多态性分型(上海生工生物有限公司帮助完成)。

1.3.4哮喘相关指示物的检测

采集两组儿童空腹外周静脉血2mL，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测两组的TGF-β1和IL-17A水平；采用化学发光法检测血清中IgE。检测试剂盒均购于上海生工生物有限公司，并按试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组IL-17A rs2275913基因多态性和Hardy-Weinberg遗传平衡的情况

经检测，IL-17A rs2275913位点含有3种单核苷酸多态性，分别是野生型纯合子GG型、突变型杂合子GA型、突变型纯合子AA型。经Hardy-Weinberg遗传平衡验证显示，对照组、哮喘组的组内IL-17A rs2275913基因位点的预测与实测分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组Hardy-Weinberg遗传平衡检验的比较[n(%)]

2.2 两组基因型的情况

两组儿童基因型频率比较差异有统计学意义(P<0.05)，哮喘组等位基因A频率高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组儿童基因频率的比较[n(%)]

2.3 两组TGF-β1、IgE和IL-17A水平的情况

对照组TGF-β1、IgE和IL-17A水平均低于哮喘组(P<0.05)，见表3。

表3 两组儿童TGF-β1、IgE和IL-17A水平的比较

2.4 哮喘儿童不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平的情况

哮喘组患儿不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且基因型AA和GA携带者表达的TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于基因型GG，见表4。

表4 哮喘儿童不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平的比较

2.5 IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘的关系

以GG型基因为基值，对3种基因型和哮喘风险的关系进行二元Logistic回归分析显示，基因型GA、基因型AA和等位基因A的携带者患哮喘的可能性是基因型GG患儿的1.831、2.431和2.146倍(P<0.05)，见表5。

表5 IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘关系的分析

3 讨论

3.1 哮喘的发病机制

哮喘是由多种基因控制，且具有遗传倾向性的呼吸道慢性疾病。哮喘的发病机制复杂，受环境、遗传等多方面因素影响。在哮喘发病机制中，普遍被学者接受的是Th1/Th2分泌失衡学说，该学说认为哮喘患者体内Th1/Th2比例失衡，其是由于Th0细胞、Th2细胞分化增加，导致Th1细胞分泌的细胞因子降低，Th1细胞功能受到抑制，进而导致患者哮喘的发生[6]。IL-17由Th17细胞分泌，具有较强的促炎作用，通过对树突状细胞的刺激作用，释放炎性介质，同时激活巨噬细胞等分泌炎性因子，使气道处于高反应状态及气管重塑，IL-17的分泌还可促进IgE水平的提高。有研究发现，位于6p12.1基因上的IL-17A基因与自身免疫性疾病相关[7]。

3.2 Hardy-Weinberg遗传平衡与1IL-17A rs2275913基因多态性

有研究发现，IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘易感性有关[8]。本研究显示，IL-17A rs2275913基因位点存在3种基因型，即基因型GG、GA、AA，经Hardy-Weinberg遗传平衡验证，符合基因型频率分布，哮喘组等位基因A频率高于对照组(P<0.05)，说明IL-17A rs2275913基因位点等位基因A的突变可能是哮喘发生的危险因子。

3.3 哮喘患儿不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平的分析

有研究发现，IL-17A rs2275913基因位点等位基因A的突变可促进IL-17的分泌，而IL-17水平的升高促进了IgE分泌增加，IgE与哮喘患者气道高反应性呈正比[9]。TGF-β1可通过对上皮细胞的破坏和对杯状细胞增殖的促进，加速气道重塑和气管平滑肌细胞的增生。

本研究显示，哮喘患儿IL-17A rs2275913基因位点的等位基因A频率高于对照组，而等位基因G频率低于对照组(P<0.05)；哮喘组患儿AA基因型的频率高于对照组，基因型AA和GA患儿的TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于基因型GG患儿，且哮喘组患儿TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于对照组(P<0.05)，表明IL-17A rs2275913基因位点的等位基因A与哮喘患儿气道高反应状态和炎症因子升高有关，且等位基因G可能是哮喘患儿的保护性因子。

3.4 IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘关系的分析

本研究对3种基因型和哮喘风险的关系进行二元Logistic回归分析显示，在以GG型基因为基值，基因型GA、基因型AA和等位基因A的携带者患哮喘的可能性是基因型GG儿童的1.831、2.431和2.146倍，说明IL-17A rs2275913基因位点的等位基因A是哮喘的易感因子，增加了患哮喘的风险。

综上，IL-17A rs2275913基因位点基因型AA和GA携带者表达的TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于基因型GG。IL-17A rs2275913基因位点的等位基因由G突变为A时，增加了儿童哮喘发生率，等位基因A是哮喘的易感因子，其可作为对哮喘患者早期预防和治疗的参考。