Zn2+对香菇菌丝胞外多糖抵御镉影响研究

乔 鑫杨 军 边银丙

（1.武汉商学院食品科技学院 湖北·武汉 430056；2.华中农业大学应用真菌研究所 湖北·武汉 430071）

随着我国工业的快速发展及三废的大量排放，重金属污染危及健康的问题受到广泛关注。重金属污染已涉及我国部分食用菌产品，曾经发生一些国家和地区拒绝进口我国被污染的食用菌产品事件[1-4]。食用菌对有害重金属有较强的富集能力，而镉是食用菌中最常见的污染重金属元素之一，其中，香菇对镉的富集能力较强[5-6]。

香菇菌丝能够分泌天然高分子聚合物，包裹在细胞壁上形成生命有机体的重要组成成分，以此来维持生命所必需结构保护细胞免受恶劣环境影响。高分子聚合物主要由分支多糖或其衍生物的长链多糖组成，以葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖为小单位，因此大分子物质富含羧基、磷酸基、氨基和羟基等主要官能团，这些官能团具有很强的重金属吸附能力，从而能够络合或隔离重金属，并阻碍重金属穿过生物膜向细胞内部扩散，起到保护细胞免受重金属毒害的作用[7-11]。培养基添加Zn2+是一种有益有效的香菇菌丝抑制重金属镉的方法，添加Zn2+不仅促进香菇菌丝生长最快，而且抑制香菇菌丝吸附重金属镉[12]。

本研究考察Zn2+添加下，碳源、碳源水平和氮源水平对香菇菌丝胞外多糖代谢量及其抗镉能力的影响，分析出Zn2+环境下香菇菌丝胞外多糖最佳生成条件，为香菇菌丝抑制重金属镉探索最佳加工工艺。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株：菌种来源于华中农业大学菌种实验中心，4℃保藏。

cym培养基：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.46g，水1L。

1.2 试剂与仪器

镉标准溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；碘化钾购自天津市凯通化学试剂有限公司；硝酸、氯化锌购自国药集团化学试剂有限公司；罗丹明B、氯化钾、氯化锰、氯化镁、氯化锌、氯化铁和氯化钙均购自天津市北联精细化学品开发有限公司。

BXM-30R高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；722可见分光光计（天津市普瑞斯仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌丝培养

取大小相同菌块接种于液体培养基中，并置于25℃下120r/min旋转式摇床上培养20d。每个水平3次重复。

1.3.2 香菇菌丝胞外多糖提取

将去除生物量的培养液，再3000rpm离心10min，取上清液置于小烧杯中，加入3倍体积95%乙醇沉淀24h后，于4800 rpm离心10min，沉淀部分即为胞外粗多糖。最后40℃真空干燥[13]。

1.3.3 镉含量测定[14-16]

（1）标准曲线的绘制。准确吸取0.10 g/mL、0.12 g/mL、0.14 g/mL、0.16 g/mL、0.18 g/mL、0.2 g/mL 镉的标准溶液于25mL比色管中，后加入2mL，1mol/L硫酸溶液、7mL碘化钾（200g/L)溶液，摇匀，静置2min，再加5mL1%PVA-124溶液，摇匀，沿管壁慢慢加1.5mL 0.05%罗丹明B，静置1min，再慢慢摇动液体，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置5min，用1cm比色皿在620nm波长处，以试剂空白为参比，测定吸光度，绘制镉标准曲线。

（2）湿法消解。称取0.5g香菇菌丝胞外多糖于25ml锥形瓶内，放数颗玻璃珠加10ml混合酸（硝酸：高氯酸（9:1）），加盖浸泡过夜后，置于电热板上消解。将消化液装25ml容量瓶中并定容，同时做空白试剂。用分光光度计进行检测。

1.3.4 实验设计

（1）碳源类型。配制含锌镉各1mg/L培养基，溶液pH值调至6，分别加入20 g葡萄糖、20g麦芽浸粉、20g玉米粉三种碳源，于25℃温度下培养20天，每种碳源重复3次，考察不同碳源Zn2+对香菇菌丝胞外多糖在镉胁迫下的影响。

（2）碳源水平。以最优碳源麦芽浸粉为碳源，在含锌镉各1 mg/L培养基中分别添加5 g、10 g、15 g、20 g和25 g的麦芽糖，溶液pH值调至6，于25℃温度下培养20天，每种碳源水平重复3次。考察不同碳源浓度 Zn2+对香菇菌丝胞外多糖在镉胁迫下的影响。

（3）氮源水平。以麦芽浸粉和蛋白胨作为碳源和氮源，每组添加20g麦芽浸粉，再分别添加不同量的蛋白胨，使氮碳比值分别为0、1:10、1:15、1:20和1:25，即0g、0.8g、1g、1.33g和2g，最后调制成含锌镉各1 mg/L培养基，每种氮碳比重复3次。考察不同氮碳比 Zn2+对香菇菌丝胞外多糖在镉胁迫下的影响。

1.4 数据处理

所有数据均采用Excel2013、统计分析软件SPSS16.0进行整理及分析。

2 结果与分析

2.1 镉标准曲线的绘制

以镉标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1和图1。

表1：镉标准液吸光度

图1：镉的标准曲线

由表1和图1可知，镉标准曲线的一元线性回归方程为y=14.438x+0.0291，相关系数R2为0.9995大于0.995，镉标准曲线符合要求。

2.2 碳源类型

Zn2+可有效降低香菇菌丝吸附重金属镉，碳源的种类是香菇菌丝胞外多糖生成及其吸附抗镉毒性的重要决定因素，研究Zn2+环境下不同碳源对胞外多糖的影响。从图2可知，不同碳源培养基的代谢产物胞外多糖量和胞外多糖附镉能力有明显的区别，胞外多糖产量多少为麦芽浸粉＞玉米粉＞葡萄糖，胞外多糖附镉能力大小为麦芽浸粉＞葡萄糖＞玉米粉。其中麦芽浸粉的胞外多糖产量最高，而且胞外多糖附镉能力最好，所以碳源麦芽浸膏更适合香菇菌丝抵御重金属镉对菌丝内部毒害。麦芽浸粉含有丰富淀粉，有利于香菇菌丝生长发育和多糖的积累。所以，麦芽浸粉最适合作为香菇菌丝碳源，胞外多糖代谢量多，而且抑制重金属镉效果最好。

图2：不同碳源对香菇菌丝胞外多糖量和胞外多糖附Cd量的影响

2.3 碳源水平

碳源浓度调控着香菇菌丝胞外多糖生成量，研究Zn2+环境下不同碳源浓度对香菇菌丝胞外多糖产量及抗镉能力。根据前期试验，选取麦芽糖为碳源。由图3可知，胞外多糖产量和胞外多糖附镉能力均呈持续增长趋势。低浓度5 g麦芽糖培养基中营养不充足，导致菌丝生物量和胞外多糖产量受到了限制，香菇菌丝呈现很弱的抗镉能力。菌丝随着培养基中麦芽糖浓度的增高，菌丝对镉的抗性增强；碳源浓度达到15g时，菌丝胞外多糖产量出现快速增长，相对于碳源浓度10g时胞外多糖产量增长了25.8%；当浓度达到25 g时，胞外多糖产量最大，且胞外多糖耐镉能力也最强，但浓度越高胞外多糖产量增长缓慢，抵抗重金属镉的能力却明显增强。总之，高浓度的碳源对胞外多糖的合成有促进作用，浓度达到一定时胞外多糖产量受到抑制，但是大量胞外多糖的产生，对香菇菌丝抵御重金属镉能力增强。

图3：不同麦芽浸粉含量对香菇菌丝胞外多糖量和胞外多糖附Cd量的影响

2.4 氮源水平

氮源能提供微生物生长发育所必需的营养物质，是合成蛋白质和核酸所必不可少的原料，适合的氮源有利于菌体的生长代谢和胞外多糖合成，Zn2+对蛋白质合成存在影响，研究Zn2+环境下不同浓度氮源对香菇菌丝胞外多糖及抗镉能力影响。由于培养基中酵母膏和蛋白胨里面含有一定的碳源，不仅数量少，而且不易被细胞利用，因此计算氮碳比时仅将两者作为氮源，又因为蛋白胨富含氮源较多，所以以蛋白胨作为氮源变量。本实验选择20g麦芽浸粉作为碳源，根据氮碳比确定加入蛋白胨的含量。通过图4可知，未添加氮源的香菇菌丝代谢胞外多糖和胞外多糖附镉量低于添加氮源的，说明氮元素是菌丝生物体重要组成成分，能够促进细胞分裂增加菌体密度，促进糖类物质向多糖的转化。随着氮源浓度的增加，菌丝胞外多糖的代谢量和胞外多糖附镉量出现先增加后降低的趋势，低浓度氮源不足以满足促进胞外多糖生成，高浓度氮源抑制胞外多糖生成，氮源浓度1.33g胞外多糖产量是氮源浓度0.8g的1.13倍，氮源浓度1.33g胞外多糖产量是氮源浓度2g的1.06倍。总之，碳氮比20:1，即氮源浓度1.33g，不仅胞外多糖产量高而且抗重金属镉最强。

图4：不同蛋白胨含量对香菇菌丝胞外多糖量和胞外多糖附Cd量的影响

3 小结

胞外多糖具有吸附重金属镉的能力，Zn2+也是抑制香菇菌丝吸附重金属镉重要影响因素。本文主要研究 Zn2+环境下，香菇菌丝培养基营养成分（碳源种类、碳源水平、氮源水平）对香菇菌丝胞外多糖代谢量和抵抗镉的效果。

碳源种类对香菇菌丝胞外多糖代谢抗镉影响显著。麦芽浸粉相比玉米粉更易代谢胞外多糖抵抗重金属，所以最适合碳源为麦芽浸粉。不同的碳源水平对香菇菌丝胞外多糖代谢有一定影响。高浓度的碳源能够促进胞外多糖的合成，提高菌丝抗镉毒害。不同的氮源水平对香菇菌丝胞外多糖合成有影响。碳氮比20:1，即氮源浓度1.33g，不仅胞外多糖产量高而且抗重金属镉最强。