黄皮根中欧前胡素的提取及含量测定

陆峥琳，黄瑞松，吴氏海燕

（1.广西国际壮医医院，南宁 530001；2.广西医科大学药学院，南宁 530022）

黄皮根来源于芸香科植物黄皮（Clausena lansinm）的干燥根。黄皮在中国南方多地均有栽培［1］，黄皮果实为大众所喜食的果品，除此之外民间还以黄皮的根、叶、果、果核等入药［2，3］。黄皮根性辛、微苦，温，具有行气止痛之功，可用于治疗气滞胃痛、腹痛、疝痛、风湿骨痛、痛经、黄疸、疟疾［4-8］。关于黄皮根的研究不多。文献记载［4］黄皮根中含欧前胡素、去氢印黄皮内酯、8-牻牛儿氧基补骨脂素和倍半萜酮右旋日本刺参萜酮等成分。其中，欧前胡素又名欧前胡内酯、欧芹属素乙、前胡内酯、白芷乙素，是线性呋喃香豆素类化合物，具有抑制癫痫发作、扩张血管、抑制心肌肥大、抑制肿瘤细胞增殖、抗微生物、影响新陈代谢酶活性等多种药理作用［9，10］。目前尚未见有黄皮根中欧前胡素含量测定的报道，本研究采用单因素试验和正交设计对黄皮根中欧前胡素提取条件进行优化，建立了黄皮根中欧前胡素含量的高效液相色谱测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

黄皮根（1号2016年1月6日采于广西隆安县龙虎山景区；2号2016年2月18日采于广西凤山县凤城镇；3号2016年4月1日采于广西隆安县那桐镇），3批黄皮根样品对应的带花腊叶标本经广西中医药大学韦松基教授及广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为芸香科植物黄皮；欧前胡素对照品（批号110826-201415，纯度为99.7%，供含量测定用），中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈色谱纯，德国Merck公司，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（带自动进样器及VWD检测器），美国安捷伦科技公司；LC-20 AT高效液相色谱仪（带自动进样器、二极管阵列检测器）、UV-2401PC紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；KQ-3200DE型数控超声波清洗器，昆明市超声仪器有限公司；XS205十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；EASYPUREⅡ超纯水器，美国热电公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

1）色谱柱的选择。在其他色谱条件相同的情况下，分别采用岛津C18、赛芬C18和菲罗门Gemini NX C1（8规格均为5 μm，4.6 mm×250 mm）3根不同色谱柱测定黄皮根样品（2号），比较其分离效果。

2）流动相的选择。在同一色谱条件下，分别对甲醇-水（55∶45）、甲醇-水（60∶40）以及乙腈-水（55∶45）3个流动相系统进行试验。

3）分析波长的选择。取欧前胡素对照品的甲醇溶液，经UV-2401PC紫外-可见分光光度计在190～400 nm进行紫外光谱扫描，确定欧前胡素的最大吸收波长。

1.3.2 供试品溶液制备方法的研究

1）单因素试验。以欧前胡素含量为指标，考察不同提取溶剂及不同提取方法的效果。欧前胡素为呋喃香豆精类，结合其化学性质及参考有关文献［11-13］，拟定提取溶剂考察甲醇、乙醇，提取方式考察超声处理、加热回流。精密称取黄皮根（2号）粉末4份，每份约0.5 g，精密加入溶剂15 mL，密塞后称定重量。以甲醇超声处理、乙醇超声处理、甲醇加热回流、乙醇加热回流提取30 min，静置放冷，用相应的溶剂补足减少的重量，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪测定。

2）正交设计优化试验。依据单因素试验结果，对药材破碎度、溶剂体积分数、提取时间进行三因素三水平考察，因素与水平见表1。以欧前胡素的含量为考核指标，采用L9（34）正交设计安排试验。

表1 正交试验设计因素水平

1.3.3 方法学考察

1）专属性试验。精密称取欧前胡素对照品适量，加甲醇制成浓度为30 μg/mL的溶液，作为对照品溶液；精密称取黄皮根粉末0.5 g，按供试品溶液制备方法的优化结果制备供试液，以0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；以甲醇溶液作为阴性对照溶液。取上述3种溶液各10 μL，进样测定并记录色谱，考察该方法测定欧前胡素含量有无阴性干扰。

2）线性关系。精密称取欧前胡素对照品8.2 mg，加甲醇定容至25 mL。分别精密吸取0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述不同浓度对照品溶液各10 μL进样测定，以对照品的进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

3）精密度试验。取同一份黄皮根药材的供试品溶液（2号），连续进样测定6次。分别记录欧前胡素峰面积，计算RSD值。

4）重复性试验。取黄皮根药材（2号）粉末，分别精密称定0.5 g，平行制备6份供试品溶液，进样测定欧前胡素含量并计算RSD值。

5）稳定性试验。取黄皮根药材同一供试品溶液（2号），分别于0、2、4、6、12、24 h进样测定，计算人参皂苷Rb1含量及RSD值。

6）加样回收率试验。分别精密称取已知含量的黄皮根粉末（2号）0.25 g共6份，各加入欧前胡素对照品的甲醇溶液（26.61 μg/mL）15 mL，照供试品溶液制备方法的优化结果制备供试品溶液，测定欧前胡素含量，计算平均回收率及RSD值。

7）检测限及定量限的确定 取欧前胡素对照品甲醇溶液按不同比例进行稀释，计算信噪比S/N=3、S/N=10时注入仪器的量，分别得欧前胡素对照品的检出限及定量限。

8）耐用性试验。分别采用岛津C18、赛芬C18和菲罗门Gemini NX C1（8规格均为5 μm，4.6 mm×250 mm）3根不同品牌色谱柱，测定黄皮根样品（2号）中欧前胡素的含量及RSD值；分别采用安捷伦1260型和岛津LC-20AT 2台不同品牌的色谱仪，测定黄皮根样品（2号）中欧前胡素含量，计算RAD值。

1.3.4 样品含量测定 精密称取3批黄皮根样品，制备供试品溶液，按照确定的色谱条件测定黄皮根中欧前胡素的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 色谱柱的确定 岛津C18、赛芬C18和菲罗门Gemini NX C1（8规格均为5 μm，4.6 mm×250 mm）3根色谱柱对欧前胡素均可得到良好的分离效果。选择菲罗门Gemini NX C18柱作为试验用色谱柱。

2.1.2 流动相的确定 在同一色谱条件下，以甲醇-水（55∶45）为流动相，分离效果优于甲醇-水（60∶40）、乙腈-水（55∶45），故以甲醇-水（55∶45）进行试验。

2.1.3 检测波长的确定 欧前胡素在图1所示的几个波长均有吸收峰，结合黄皮根样品的高效液相色谱，其在300 nm波长处杂质峰干扰较小，故本研究选用300 nm为检测波长。

图1 欧前胡素甲醇溶液紫外光谱

2.2 供试品溶液制备方法的优化结果

2.2.1 单因素试验结果与分析以不同溶剂及不同提取方式制备黄皮根样品溶液，测欧前胡素含量，结果见表2。以甲醇、乙醇2种不同溶剂提取的欧前胡素含量相差不大；以超声提取法和加热回流提取法提取时，前者欧前胡素含量明显优于后者。本研究确定采用甲醇超声提取的方法制备供试品溶液。

表2 单因素试验制备的供试液欧前胡素含量（n=2）

2.2.2 正交试验结果 正交实验结果与方差分析见表3、表4。影响提取黄皮根中欧前胡素含量的因素大小顺序为：药材破碎度＞甲醇体积分数＞提取时间，药材破碎度对试验结果影响较大，提取时间对试验结果影响较小，综合考虑，确定最佳提取条件为A3B3C1。

表3 正交试验结果

表4 正交试验结果方差分析

2.2.3 供试品溶液制备方法的确定综合单因素试验及正交试验结果确定供试品溶液制备方法为：精密称取黄皮根粉末（过四号筛）0.5 g，置锥形瓶中，精密加入15 mL甲醇并密塞，称定重量，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）30 min，放至室温，以甲醇补重，摇匀，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 专属性试验结果供试品溶液的色谱中均有与欧前胡素对照品保留时间相同的吸收峰，甲醇阴性溶液的色谱则无此吸收峰。说明用该方法测定欧前胡素含量无阴性干扰，专属性强。结果见图2。

图2 对照品（A）、供试品（B）和阴性对照（C）HPLC色谱

2.3.2 标准曲线的绘制欧前胡素进样量在0.065 6～1.640 0 μg，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=2 400.3X+3.069 4，r=0.999 8。式中，X为欧前胡素进样质量，Y为峰面积，标准曲线如图3所示。

图3 欧前胡素的标准曲线

2.3.3 精密度试验结果 连续测定6次，欧前胡素峰面积分别为1 131.0、1 121.0、1 116.5、1 115.6、1 111.8、1 118.4，平均值为1 119.1，RSD=0.59%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验结果 平行测定6份供试品溶液，欧前胡素含量分别为0.158%、0.157%、0.158%、0.158%、0.157%、0.154%，平均值为0.157%，RSD为0.96%（n=6），表明该试验方法重复性较好。

2.3.5 稳定性试验结果24 h内6次测定供试品溶液，欧前胡素含量分别为0.154%、0.155%、0.155%、0.157%、0.157%、0.155%，平均值为0.156%，RSD为0.87%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验结果 黄皮根样品溶液的欧前胡素平均回收率为97.2%，RSD为0.89%（n=6）（表5），说明该方法准确度高，可用于测定黄皮根中欧前胡素的含量。

表5 黄皮根中欧前胡素的加样回收试验（n=6）

2.3.7 仪器检出限及定量限的确定测得欧前胡素对照品的检出限为3.28×10-4μg，定量限为1.1×10-3μg。

2.3.8 耐用性试验结果3根不同品牌色谱柱测得黄皮根样品（2号）中欧前胡素的含量分别为0.147%、0.149%、0.145%，平均值为0.147%，RSD为1.36%（n=3）；2台不同品牌的色谱仪测得黄皮根样品（2号）中欧前胡素含量分别为0.156%、0.154%，平均值为0.155%，RAD为0.65%（n=2），表明该方法对不同品牌色谱柱和不同品牌高效液相色谱仪具有良好的耐用性。

2.4 样品含量测定结果

3批黄皮根样品的欧前胡素含量按干燥品计，分别为0.170%、0.157%、0.044%。

3 讨论

色谱条件探索时曾对0.8、1.0和1.2 mL/min 3个不同流速进行比较试验，结果在上述3种流速下欧前胡素均可得到良好的分离效果，本研究采用的是1.0 mL/min的流速。同时还对25、30、35℃3种柱温条件进行考察，结果欧前胡素的分离效果均可，柱温对欧前胡素分离效果影响不大，本研究采用的是25℃。在确定的色谱检测条件下，测得3批黄皮根的欧前胡素理论板数均大于3 000，符合高效液相色谱法含量测定标准。

本研究测定了3批不同产地的黄皮根欧前胡素含量，含量差距较大，可能和药材的生境或采集月份有关，有待采集多批样品测定进行下一步研究。

本研究基于高效液相色谱法建立黄皮根药材中的欧前胡素含量测定法，供试品制备方法简便，色谱分离好，无其他成分干扰，具备较好的专属性。经方法学考察，重复性、精密度好，准确度高，可用于黄皮根质量标准的评价，有利于控制药材质量，为黄皮根资源的开发利用和规范化种植及进一步制定黄皮根药材质量标准提供了科学依据。