DNA甲基化酶3A在动脉粥样硬化中的作用机制

闫然，上官艺，仇鑫，李子孝，3

动脉粥样硬化是心脑血管疾病最重要的病因之一。近来的研究表明，意义不明的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）与心脑血管疾病（cardiovascular and cerebrovascular disease，CVD）风险增加相关，包括动脉粥样硬化、心肌梗死和缺血性卒中。DNA甲基化酶3A（DNA methylase 3 alpha，DNMT3A）基因为CHIP中最常见的突变基因之一[1-2]，可通过对基因进行表观遗传学修饰（DNA甲基化）而调控基因表达，引起多种疾病的发生。本文通过检索近年来相关文献，探讨DNMT3A基因突变在动脉粥样硬化中的可能作用机制，旨在探索心脑血管疾病治疗的新途径。

1 DNMT3A与CHIP

CHIP是一种由体细胞突变引起的生物学状态，用以描述存在血液肿瘤相关基因突变但还未出现肿瘤的现象，其本质是基因突变。随着年龄的增长，个体造血干/祖细胞（hemopoietic stem and progenitor cell，HSPC）发生体细胞突变，其中一些基因的突变可促进特定白细胞克隆的竞争优势和扩张，当这些突变的变异等位基因频率（variant allele frequency，VAF）≥2%且无严重的细胞减少症或世界卫生组织定义的其他血液学疾病时，被定义为CHIP。因此，CHIP是一种与年龄相关的现象，在70岁以上的人群中发生率在10%以上，且90%的CHIP相关基因突变携带者只具有单一驱动基因的突变。引起CHIP发生的基因有几十个，大多数参与表观遗传调控，DNMT3A基因是其中最常见的驱动突变基因之一，甚至可占CHIP患者的50%以上[1]。

DNMT3A基因位于染色体2p23，由26个外显子和25个内含子组成，可编码一种催化甲基转移到DNA中特定CpG结构的酶——DNMT3A。DNMT3A对非甲基化和半甲基化DNA底物具有相同的亲和力，其主要功能是参与从头DNA甲基化过程。DNMT3A基因突变使DNA甲基化过程发生紊乱，包括基因组DNA总体甲基化水平减低以及部分基因启动子区域CpG岛甲基化水平增高，从而控制基因的表达。此外，DNMT3A基因突变可改变骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的自我更新能力，使其具有向髓系分化以及转变为恶性肿瘤的倾向性[3-5]。有研究显示，携带DNMT3A基因突变的HSPC可能通过促进炎症而改变骨髓微环境，导致更持久的造血功能改变并导致HSPC有更易受损的倾向性[6]。

2 DNMT3A基因突变与心脑血管疾病

越来越多的研究显示DNMT3A基因突变在CVD的发病机制中起着重要作用。Bick等[7]的研究表明DNMT3A基因突变与包括心肌梗死、冠状动脉血运重建术、卒中和死亡在内的心血管事件的发生独立相关，特别是当VAF较大（VAF≥10%）时，患者具有更大的亚临床动脉粥样硬化负担，发生心血管事件的风险也显著提升（HR1.59，95%CI1.21～2.09，P＜0.001）。在另一项研究中，研究者发现DNMT3A基因突变患者发生冠心病的风险是健康对照组的1.7倍（HR1.7，95%CI1.1～2.6，P=0.01），且早发（≤50岁）心肌梗死患者携带DNMT3A基因等CHIP相关基因突变的概率是健康对照组的4倍（OR4.0，95%CI2.4～6.7，P＜0.001）[2]，进一步表明虽然DNMT3A基因等CHIP相关基因突变的发生与年龄密切相关，但与年轻患者心血管疾病的发生也有相关性。作为心脑血管疾病的重要危险因素，高血压的发生也与DNMT3A基因突变相关。近年来的研究认为DNA甲基化程度与血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性和收缩压水平呈明显负相关，DNMT3A表达下调会阻止肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）诱导的ACE mRNA和蛋白质的水平下降，进而调节内皮细胞炎症反应中ACE的表达水平，使血压升高[8]。相较于在心血管领域，目前在脑血管领域进行的DNA甲基化及DNMT3A基因相关的研究相对较少，需要更多的研究来进行探索。

3 DNMT3A基因突变与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种血管壁内的慢性炎症疾病，其发生与多种免疫细胞作用相关，是冠心病、卒中等心脑血管疾病发病的病理基础。研究表明，DNMT3A基因突变可通过巨噬细胞、肥大细胞、T细胞、单核细胞等多种免疫细胞及炎症、斑块稳定性等多种作用机制影响动脉粥样硬化的发生、发展过程。

白细胞在人类动脉粥样硬化斑块中大量存在，而巨噬细胞是动脉粥样硬化中最丰富的白细胞类型。在小鼠模型研究中，Sano等[9]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术使DNMT3A基因发生失活突变，随后将血管紧张素Ⅱ输注至小鼠体内，结果在心肌组织中可观察到更多巨噬细胞蓄积，伴随着免疫细胞标志物（包括CD68、CD3e、CD4和CD8）的转录水平升高，提示DNMT3A缺乏会导致心肌炎症的增加。进一步在脂多糖处理后，可观察到细胞中趋化因子配体1（chemokine ligand 1，CXCL1）、趋化因子配体2（chemokine ligand 2，CXCL2）、IL-6和趋化因子配体5（chemokine ligand 5，CCL5）等炎症因子表达水平上调，证明DNMT3A在炎症反应中的作用具有复杂性。还有研究认为DNMT3A可通过作用于组蛋白去乙酰化酶9（histone deacetylase 9，HADC9）引起TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）脱乙酰作用来调控巨噬细胞，进而对炎症进行调控[10]。近来还有学者将目光聚焦于斑块愈合，认为动脉粥样硬化斑块不稳定和愈合之间的平衡被打破很可能是临床急性血管事件发生的基础[11]。在动物实验和临床研究中，M2巨噬细胞都已被证明在动脉粥样硬化斑块稳定性和动脉粥样硬化消退中有潜在作用[12-13]。IL-4、IL-13等细胞因子可促使M2巨噬细胞分泌抗炎细胞因子，如IL-10等。这些抗炎细胞因子能够抵消M1巨噬细胞的促炎活性，并促进组织修复。M2a巨噬细胞可生成促进纤维化的因子，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，促进动脉粥样硬化斑块愈合[14-16]。DNMT3A基因突变可能通过巨噬细胞促进炎症、影响斑块稳定性等机制促进动脉粥样硬化的发生、发展。

肥大细胞是动脉粥样硬化发展过程中重要的炎症介质，同时也受DNMT3A基因的调节。Leoni等[17]发现DNMT3A在调节肥大细胞对急性刺激和慢性刺激的反应中起着关键作用，其认为DNMT3A是通过调节肥大细胞中支架蛋白IQGAP2基因的表达来控制炎症细胞因子的表达，进而对炎症进行调控。在急性刺激下，缺乏DNMT3A的肥大细胞对微环境干扰的敏感性增加，释放胞质颗粒的能力显著提高。同时，各种细胞因子（包括IL-6、TNF-α和IL-13）的分泌增加。这些效应与IQGAP2基因位点的DNA甲基化变化部分相关，且此过程不依赖活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）。除此之外，研究还表明DNMT3A可能存在与DNA甲基化活性无关的功能，导致了其对炎症的抑制。需要更多深入的研究来阐明DNMT3A在动脉粥样硬化过程中对肥大细胞进行调节的作用机制。

此外，Mas-Peiro等[18]的研究表明携带DNMT3A基因突变的患者辅助性T细胞（T helper cell，Th）17与调节性T细胞（regulatory cell，Tregs）的比例增加。Abplanalp等[19]的研究发现DNMT3A基因突变携带者Th1、Th2、Th17、CD8+效应T细胞、CD4+记忆T细胞和Treg特异性信号表达增加。Th17细胞和Treg细胞及其分泌的细胞因子在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起着重要作用。在临床研究和动物实验中均表明Th17可以促进动脉粥样硬化的炎症反应[20-21]。Treg细胞在动脉粥样硬化中发挥保护作用[22]，Tregs比例增加可减小动脉粥样硬化的面积[23]，甚至可使已形成的动脉粥样硬化消退[24]。Treg细胞可能分泌IL-10和TGF-β，从而通过降低外周和大脑中的细胞因子水平，抑制小胶质细胞的激活、减轻局部炎症反应、促进斑块愈合等机制作用于缺血的脑组织[25]。近来，Sharma等[26]发现Tregs在动脉粥样硬化消退过程中富集于斑块中，对于动脉粥样硬化炎症减退和晚期斑块收缩至关重要。IL-2、IL-4、IL-13和IFNG基因受T细胞DNA甲基化的调控[27-29]，这与在肥大细胞中观察到的表型相似，进一步证实了DNMT3A在炎症反应调节中的重要性。

最近，Abplanalp等[30]的一项单细胞RNA测序研究发现，携带DNMT3A基因或TET2基因突变的严重变性主动脉瓣狭窄或慢性缺血后心力衰竭患者的外周血单核细胞显示IL-1β、IL-6受体，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）和CD163表达增加；采用单细胞RNA测序法分析了6例携带DNMT3A基因突变的心力衰竭患者和4例无DNMT3A基因突变的心力衰竭患者外周血单核细胞的转录谱，发现携带DNMT3A基因突变的心力衰竭患者IL-1β、IL-6、IL-8、炎性小体NLRP3、巨噬细胞炎性蛋白趋化因子配体3（chemokine ligand 3，CCL3）和趋化因子配体4（chemokine ligand 4，CCL4）以及增强单核细胞-内皮黏附的抵抗素基因特异性上调[19]。T细胞刺激免疫球蛋白超家族成员CD300LB、CD83、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素12（sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin 12，SIGLEC12）以及CD2配体和细胞黏附因子CD58的表达增加，而后者可能参与了单核细胞与T细胞的相互作用。

4 展望

DNMT3A基因突变刺激HSPC克隆并使其后代扩增，克隆血细胞可能通过驱动IL-6、IL-13等细胞因子及趋化因子的释放来促进动脉粥样硬化的进展，并导致CVD的发生。未来可能通过进一步的研究为CVD的治疗提供新靶点，亦或降低CVD的发病风险，如研发阻断下游炎症因子或直接抑制克隆突变的药物等。目前，与CHIP相关的其他基因突变研究已有了实质性的进展，抗炎药如IL-1β和NLRP3炎性小体的抑制剂可作为CHIP相关CVD的潜在疗法[31]，相信通过对DNMT3A的进一步研究可为该病因卒中患者提供更精准的治疗方案。

综上所述，DNMT3A可能通过影响炎症、斑块稳定性、血压等作用于动脉粥样硬化，进而造成心脑血管疾病的发生、发展。目前，对CHIP在心脑血管疾病中作用机制的研究尚处于初期阶段，未来研究要进一步明确DNMT3A在心脑血管疾病中的作用通路，将有助于进一步研究心脑血管疾病的病因及制订针对该突变类型患者的精准治疗策略。

【点睛】DNMT3A基因是CHIP中的热点突变之一，可通过多种作用影响动脉粥样硬化，进而造成心脑血管疾病的发生、发展。目前关于DNMT3A基因突变在动脉粥样硬化中的作用机制的研究尚处于初期阶段，需要进一步的研究明确其作用通路。