MLCK 在慢性心力衰竭中作用机制的研究

杨 楠，李雪萍，宋 梅，李 亚，许钢柱

（1.西安医学院临床医学院，陕西 西安 710021；2.陕西省西安市西安医学院第一附属医院内分泌科，陕西 西安 710000；3.陕西省西安市西安医学院第一附属医院神经外科，陕西 西安 710000）

心力衰竭（heart failure）是心血管疾病发展的最终阶段，其是一种涉及多种过程的临床综合征，由许多细胞变化引起的复杂性疾病，包括影响多种肌原纤维蛋白磷酸化的变化，5 年病死率高达50%，其日益增加的发病率也为人类造成了严重的经济和社会负担[1-3]。肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是调节肌球蛋白调节轻链（RLC）的关键酶，肌球蛋白调节轻链磷酸化在心肌中通过调节钙/钙调素增加Ca2+敏感性来调控心肌细胞的收缩，研究表明[4]，MLCK 是维持正常心脏功能所必需的一种激酶，其在调节心功能中起着重要的作用。既往研究发现[5，6]，心肌MLCK 是在心力衰竭细胞中发现的，它可能不仅在心脏的生理表现中，而且在病理生理应激的适应性反应中发挥作用。本文主要就MLCK 分子家族成员及分布、MLCK 在心肌收缩中的作用及MLCK 与慢性心力衰竭的关系作一综述。

1 MLCK 分子家族成员及分布

MLCK 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是钙/钙调素依赖性蛋激酶家族中的一员[7]，参与重要的生命活动，由MLCK1、2、3 和4 四种激酶组成，它们分别由MYLK1、MYLK2、MYLK3 和MYLK4 四种不同的基因编码[6，8，9]。根据其对不同肌类型的表达特异性，MLCK1 被称为平滑肌MLCK（smMLCK），主要存在于平滑肌细胞中；MLCK2 被称为骨骼肌MLCK（skMLCK），主要存在于骨骼肌细胞中；MLCK3 被称为心肌MLCK（cMLCK），存在于心肌细胞中；MLCK4是最新被发现的可能是另一种不同于MLCK3 的心肌MLCK，其仅在心肌细胞中选择性表达，这些激酶在肌肉的收缩和舒张中起着至关重要的作用。

MLCK1 在平滑肌组织中的表达水平最高，但它不是一种平滑肌特异性蛋白，在心肌组织中也有表达[10]；MLCK2 不仅在骨骼肌中表达，在心肌中也有少量表达[11,12]；MLCK3 仅在心室和心房中特异表达[5]，cMLCK 是维持正常心脏生理功能基础的一种激酶，其对维持正常的心肌收缩和舒张非常重要[4]。粗肌丝的结构是决定心肌性能的重要因素，粗纤维主要由肌球蛋白（myosin）和肌球蛋白结合蛋白（MyBPC）组成，肌球蛋白是一种运动蛋白，由1 条重链（myosin heavy chain，MHC）和2 条轻链（myosin light chain，MLC）构成，MLC 则包含1 对基本轻链（ELC）和1 对调节性轻链（RLC），MHC 可以与ELC 和RLC 两条轻链结合，并与相邻的MyBP-C 相互作用，从而调节心肌收缩[13]。cMLCK 是磷酸化RLC 的主要激酶，右心室和浦肯野纤维中cMLCK 和RLC磷酸化的表达高于左心室[14]。有研究表明[12]，在左室中心尖和心外膜MLCK 含量较心底和心内膜含量高，RLC 磷酸化水平也呈梯度变化，表现为内层低、外层高，这种梯度是心肌细胞外层磷酸酶活性降低形成的，可能是导致心肌细胞跨比不均匀收缩特性的关键[15,16]。在小鼠新生心肌细胞中，cMLCK 广泛分布于胞浆中，RLC 的N-末端区域包含MLCK 特异性磷酸化位点，但在某些区域cMLCK 不与其基质RLC 结合[5]，这一发现表明cMLCK 磷酸化RLC 可能仅仅是其功能的一部分。正常小鼠和人体心脏中，心肌细胞RLC 磷酸化水平保持恒定，占RLC 总量的30%～40%[17,18]，而在RNA 抑制导致cMLCK 表达缺失的心肌中，心肌RLC 的磷酸化水平仅降低50%，这表明其他激酶也发挥了重要作用。目前研究发现MLCK4 在心肌中也有大量表达，但与其他MLCK 家族成员不同的是，MLCK4 有一个“假调节螺旋”（PRH）代替了一个完整的自我调节片段。从MLCK4 的晶体结构和与其他MLCK 家族成员的序列比较，MLCK4 是一种无钙/钙调素依赖性的活性激酶[9]。心肌细胞中MLCK4 的表达是cMLCK 的20倍[19]，但MLCK4 的Vmax 值是cMLCK 的50 倍，提示MLCK4 可能是使心肌细胞RLC 磷酸化的又一个重要贡献者[9]。总之，四种不同类型的MLCK 在心肌组织中均有表达，可通过磷酸化RLC 调节心肌细胞的收缩。

2 MLCK 在心肌收缩中的作用

近年来研究表明心肌RLC 的磷酸化可增强心脏的收缩速度和收缩力，而MYLK3 基因编码的cMLCK 是磷酸化RLC 的主要激酶[20]。Hodatsu A 等[21]研究发现，MLCK 激活RLC 磷酸化并诱导肌节组织收缩，心肌细胞中MLCK 介导肌节收缩存在多种机制，一种可能是通过RLC 磷酸化改变肌球蛋白的构象，这促进肌球蛋白丝的形成；另一种可能是促进肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用。此外，MLCK 可能作为一种适应机制，在肥大刺激的影响下增加心肌细胞内钙水平，从而使心肌最大收缩力增强。

心肌收缩蛋白包括肌球蛋白、肌动蛋白和原肌凝蛋白3 种蛋白组成，心肌收缩和舒张是由肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用驱动的，并与ATP 的水解作用相结合[22]，钙与肌钙蛋白的结合触发肌动蛋白细肌丝的激活，这使邻近的肌动蛋白粗肌丝的头部区域能够强烈地附着在肌动蛋白结合位点上，引起肌球蛋白头部结构域部分小构象变化，导致肌肉收缩[23]。心脏RLC 在很大程度上是由MLCK 磷酸化的，在外源性MLCK 浸泡的心肌纤维中，它能诱导激活最大水平的钙[18]。此外，在含有丙氨酸残基取代N 末端丝氨酸的转基因小鼠体内心脏RLC 水平降低且心肌收缩力明显受损[24]。cMLCK 磷酸化RLC 可提高离体心肌纤维的钙敏感性，并被认为可以控制完整心脏的收缩力和肌力，增强心肌的收缩功能[25]。

肌动蛋白是一种二聚蛋白质，哺乳动物有4 个肌动蛋白基因，分别为ACTN1、ACTN2、ACTN3 和ACTN4，α-肌动蛋白2 由ACTN2 基因编码，它是心肌中的主要Z 盘蛋白，由3 个肌动蛋白结合位点和两对EF-手型基序组成。ACTN2 通过促进肌动蛋白的作用在肌节组织中起关键作用，ACTN2 与缺血性和非缺血性心力衰竭显著相关，并且在左室舒张不良和射血分数降低的心力衰竭中起作用，提示其在各种初始损伤导致左心室不良重构的机制中可能起作用[26]，它的基因突变还可导致肥厚性心肌病[27]。有研究表明[28]，cMLCK 主要在Z 盘表达，在肌节中也有部分表达，与具有高亲和力的α-肌动蛋白2 相互作用调节心肌收缩功能。因此，MLCK 家族中cMLCK 是引起心肌组织收缩的主要激酶，其主要通过作用于肌球蛋白和肌动蛋白，从而调节心肌的收缩与舒张。

3 MLCK 与慢性心力衰竭的关系

心肌肌球蛋白轻链激酶（cMLCK）的表达和RLC 磷酸化降低与慢性心力衰竭有关，cMLCK 是负责RLC 磷酸化的主要激酶，cMLCK 的表达减少可以降低心肌RLC 磷酸化水平，从而导致心力衰竭[9]。在动物模型中，无论是cMLCK 的消融还是RLC 磷酸化本身都会导致心肌功能障碍和病理性肥大[4，17]。相反，在转基因动物模型中增加RLC 磷酸化具有心脏保护功能[29]。有研究发现[30]，smMLCK 也可使RLC的磷酸化，smMLCK 在平滑肌和心脏RLC 磷酸化方面同样有效，且体内心脏磷酸化可能依赖于130 kDa smMLCK 的活性，故smMLCK 可能是心脏衰老或疾病导致相关cMLCK 表达下降的后备激酶。丝氨酸15（S15）是心肌RLC 最重要的磷酸化位点[6]，人心室肌球蛋白轻链激酶可使心肌肌球蛋白调节轻链S15磷酸化，从而改变心肌RLC 的二级结构，并调节心肌组织对Ca2+的敏感性，进而调节心肌收缩力。目前有研究表明[31]，smMLCK 能特异性地磷酸化猪心室肌球蛋白和鸡胃平滑肌肌球蛋白中的肌球蛋白调节轻链S15（平滑肌中的S20）。在横纹肌组织中表达130 kDa 的smMLCK，除了调节心肌肌球蛋白的活性外，还可能调节在这些组织中表达的非肌肌球蛋白Ⅱ的运动活性。也有研究表明[10]，smMLCK 在心肌细胞搏动中有表达。因此在心脏发育过程中，smMLCK 可能参与调节肌球蛋白运动，并在维持心肌搏动中发挥作用。

收缩期心肌收缩的激活是通过钙与肌钙蛋白C（TnC）的结合进行的，这会引起肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）、肌钙蛋白T（TnT）和肌钙蛋白（Tm）之间的构象变化和相互作用的改变[13]。Sevrieva IR 等[32]研究发现，cMLCK 并不是一个专门的肌球蛋白激酶，它还可以以钙/钙调素依赖的方式磷酸化人心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），它还是肌丝钙敏感性和松弛动力学的一个重要调节因子。cMLCK 的离体蛋白制剂在肌肉纤维的环境中能在丝氨酸23（S23）上特异性地磷酸化人cTnⅠ，这对心肌的收缩功能具有重要的意义。心力衰竭发展过程中β 肾上腺素能使受体脱敏导致cTnⅠ脱磷，通过受损的长度依赖性激活（心脏FrankStarling 定律）导致心肌功能障碍，因此，通过调节cMLCK 活性来增加心力衰竭心脏cTnⅠ磷酸化是开发新的心力衰竭干预措施的潜在新靶点。Warren SA 等[33]敲除cMLCK 基因的小鼠模型中发现，左心室明显增大且左室收缩功能减退，并出现了严重的收缩和舒张功能障碍，而cMLCK 基因过表达的小鼠心室大小和心肌收缩力没有明显变化，其原因可能为cMLCK 表达的减少导致RLC 磷酸化的减少，在介导心脏从代偿性肥大向失代偿性肥大的转变中起着关键作用，在慢性心力衰竭的发展中，泛素-蛋白酶体依赖性蛋白降解可能加速了cMLCK蛋白降解，使得RLC 磷酸化水平降低导致心脏由代偿性肥厚向失代偿性心力衰竭转变。而cMLCK 的大量表达可减轻压力超负荷下心力衰竭的发展，对正常心功能则无明显不良影响。Hodatsu A 等[21]在一项纳入日本149 例（男性109 例，女性40 例）无血缘关系的扩张性心肌病（DCM）患者的研究中发现了外显子9 的剪接受体位点的一个单突变（p.Pro639Valfs*15），mRNA 衍生的反转录PCR 产物的序列分析表明，p.Pro639Valfs*15 引起外显子突变，并产生一个早熟的末端密码子，会导致蛋白质截短，而在200 名正常人中则未检测到该碱基突变；且该研究还发现，心肌即使在高浓度的突变cMLCK 中也完全缺乏磷酸化，但野生型cMLCK 的激酶磷酸化则呈正常，此外该突变仅在DCM 患者中观察到。因此，cMLCK 中基因的截断突变（p.Pro639Valfs*15）与DCM 相关的心功能障碍的发生密切相关。Fazal F 等[34]用ML-7 特异性抑制心肌细胞中MLCK 后，RLC 磷酸化水平降低，激活诱导细胞凋亡的Caspase 通路，导致心肌细胞凋亡，心肌收缩功能降低，最终导致心力衰竭。由此可见，smMLCK 与cMLCK共同参与慢性心力衰竭的发展过程，其主要通过降低RLC 磷酸化水平，使心肌收缩力减弱，进而由心肌病代偿性肥厚诱发心脏失代偿即慢性心力衰竭。此外，cMLCK 基因突变与心功能障碍密切相关，可尽早开展该靶点的治疗，预防心脏疾病的发生。

4 总结

近年来MLCK 对RLC 的磷酸化一直是临床研究的热点，因RLC 磷酸化水平的降低在心脏病和心力衰竭中起关键作用，4 种不同类型的MLCK 在心肌组织中均有表达，其中smMLCK 与cMLCK 参与慢性心力衰竭的发展过程，可通过调节肌球蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白来调节心肌收缩。cMLCK 是负责心肌RLC 磷酸化的最主要激酶，其心功能减退密切相关，可能是缓解心脏疾病的一个治疗靶点，也可能为慢性心力衰竭的治疗提供新的方向。