PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬在敌草快中毒神经元损伤中作用的研究进展

吴瑾，陆元兰，张炉英，胡杰，岑祥莹，喻安永，谢智慧

(遵义医科大学附属医院 1.急诊科，2.重症医学科，3.高压氧科，贵州 遵义 563003)

敌草快(Diquat，DQ)作为一种速效的非选择性双吡啶类除草剂，其结构与百草枯(Paraquat，PQ)相似。随着国内PQ水剂停产，DQ作为农业或家庭除草剂在市场上的销售量剧增，同时关于DQ中毒的病例报道也越来越多[1]。据研究，DQ的潜在毒性主要与它可以通过氧化还原产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，导致氧化应激致细胞死亡有关。急性DQ中毒时会造成机体多脏器损伤，如消化系统、心血管系统、肾脏和神经系统损伤等[2]。目前急性DQ中毒的治疗措施主要以减少毒物接触与吸收、清除氧自由基、抗炎等为主[3]；而对于DQ导致神经损伤的治疗仍无明显有效方案，DQ的神经毒性损伤机制也不清楚。线粒体是动态的双膜细胞器，通过氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)为机体提供活动所需能量；线粒体自噬是特异性清除受损线粒体的自噬现象，维持着线粒体的质量控制(quantity control，QC)[4]。PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)及Parkin蛋白组成自噬通路，是线粒体自噬的关键调节蛋白[5]；当机体发生急性DQ中毒时，体内骤变的氧化应激环境使线粒体膜电位发生改变，此时Parkin蛋白则被激活并招募至受损线粒体外膜上参与介导受损线粒体的自噬[6]；而PINK1作为感知受损线粒体膜电位变化的重要分子探测器，作用于Parkin蛋白的上游并调控着Parkin蛋白的转位活动。研究发现，线粒体自噬可以保护仔猪肠道细胞免受DQ诱导的氧化应激下的细胞死亡，促进了肠道内的稳态[7]，可见PINK1/Parkin信号通路调控的线粒体自噬在维持细胞正常功能方面发挥重要作用。因此探讨PINK1/Parkin信号通路调控的线粒体自噬在DQ神经元损伤机制中的作用是很有意义的。作者就PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬与DQ神经元损伤的关系作一综述，期望对DQ神经毒性有一新的认识，为DQ神经损伤治疗提供新思路。

1 PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬在神经系统疾病中的研究进展

PINK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是目前已知的唯一具有线粒体靶向结构域的蛋白激酶[8]。健康细胞中PINK1水平较低，其由含有外膜转位酶40(outer membrane transposase 40，TOM40)和外膜转位酶20(outer membrane transposase20，TOM20)核心的复合物导入线粒体，并被线粒体加工肽(mitochondrial processing peptidase，MPP)和线粒体菱形蛋白酶PARL(PINK1/PGAM5-associated rhomboid like protease)等线粒体蛋白酶依次切割，而裂解后的PINK1通过N端规则途径在细胞质中被迅速降解[9]。人类Parkin蛋白是由PARK2基因编码的具有E3泛素-蛋白连接酶活性的蛋白，主要介导底物泛素化，调节蛋白降解和信号转导等。Parkin蛋白在生理状态下处于抑制状态，当其N-端泛素样(ubiquitin-like，Ubl)结构域上丝氨酸 65(Serine65，S65)位点发生磷酸化后活性被激活[10]。当线粒体失去内膜电化学梯度即发生线粒体去极化时，PINK1向线粒体的导入被抑制，PINK1蛋白稳定在线粒体外膜上，此时线粒体上PINK1激酶活性的积累触发了Parkin蛋白的招募和激活[9]。发生活化的Parkin蛋白会促进许多外线粒体膜(outer mitochondrial membrane，OMM)蛋白的泛素化和降解，进而介导受损线粒体的自噬清除[11]。有研究显示，体内线粒体电子传递链破坏后产生过多有害活性氧(ROS)，显著诱导线粒体损伤[12]，并且这种有害效应随后可能在整个线粒体网络中传播，最终导致神经元死亡[13]。自噬是一种高度调控和保守的溶酶体介导的蛋白降解和细胞器循环过程。线粒体自噬通过清除可能成为细胞凋亡信号的受损线粒体促进细胞存活[14]。最初支持Parkin蛋白参与调节线粒体功能的研究是在果蝇中进行的，研究发现，当缺乏Parkin蛋白时果蝇线粒体出现各种异常表现，如线粒体肿胀、嵴紊乱、对毒物敏感性升高、寿命缩短和运动缺陷[15-16]。小鼠细胞缺乏Parkin蛋白时，线粒体的移动和运输可通过微管的过度乙酰化而被抑制[17]；敲除Parkin蛋白的小鼠线粒体形态和线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)水平发生改变，进而导致了多巴胺(Dopamine，DA)神经元的退化和运动障碍[18-19]。Nemes等[20]发现，在阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)神经元内的高磷酸化的微管相关蛋白tau聚集物，即神经纤维缠结(nerve fiber tangles，NFTs)中，Parkin是γ-谷氨酰键交联的主要成分，首次提示Parkin与AD之间存在关系；而Corsetti等[21]的研究表明AD个体中N末端微管结合蛋白tau的截断通过异常招募Parkin蛋白引起线粒体自噬失调，最终导致线粒体过度翻转、突触退化和神经元死亡的结果，进一步提供了在AD发病机制中的Parkin蛋白的相关机制；Fiesel等[22]研究表明，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者的大脑中存在线粒体自噬的依据。不仅如此，Lan等[23]在雄性大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤中的研究中也观察到大脑皮层缺血半暗带神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞超微结构变化及线粒体自噬现象。由此可以看出PINK1/Parkin信号通路及其调控的线体自噬在神经系统疾病中的重要性。

2 PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬与DQ中毒后神经元损伤的相关性

2.1 核因子-kB(NF-kB)/P53信号通路在DQ中毒神经元损伤中的作用

DQ为吡啶类除草剂，具有强氧化性。研究发现当PC12神经细胞暴露于DQ溶液时，DQ可抑制线粒体复合物Ⅰ活性，产生过多的ROS促使细胞色素C释放至胞质，活化半胱天冬酶-3(caspase 3)表达介导PC12神经细胞死亡，在该过程中上调的ROS导致钙离子失调，破坏线粒体膜电位，导致线粒体功能障碍[24]；NF-kB是一种普遍存在于胞质中的异二聚体，非刺激状态下以无活性状态存在[25]。氧化应激下ROS可促进蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活，活化的PKC磷酸化抑制蛋白IkB[26]，导致IkB与NF-kB解离而使NF-kB活化；NF-kB可进一步调控炎症过程，在促凋亡因子P53的启动序列中，NF-kB可以通过NF-kB位点直接调控促凋亡因子P53的表达，最终使PC12神经细胞中的NF-kB和P53表达增强，沉积于细胞质和细胞核中[24]。促凋亡因子P53在正常生理状态下可通过细胞色素C氧化酶2(cytochrome C oxidase 2，SCO2)的反式激活维持线粒体正常呼吸，但在应激状态时，ROS的生成增多促进P53诱导mieap诱导线粒体内溶酶体样细胞器(mieap-induced accumulation of lysosome-like organelles within mitochondria，MALM)的积累以修复功能不全线粒体，mieap诱导空泡(mieap-induced vacuole，MIV)完成受损的线粒体降解；当应激或损伤不可逆时，P53则会易位进入线粒体外膜，导致线粒体促凋亡基因Bax和Bak的释放。Bax和Bak分别可以形成线粒体通透性过渡孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)导致细胞色素C的释放，进一步加重线粒体功能障碍，最终可导致PC12神经细胞凋亡[27]；当PC12神经细胞经抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)预处理后，再次暴露于DQ溶液时，NAC抑制NF-kB信号及P53的表达，减轻了PC12神经细胞的凋亡[28]。以上研究说明在DQ中毒后，NF-kB与P53因子协同激活保守的线粒体死亡途径(包括Bax激活、细胞色素C释放和半胱天冬酶的激活)[24]，促进神经元死亡。

2.2 Parkin蛋白与NF-kB/P53信号通路在DQ中毒神经元损伤中的作用

DQ中毒后通过氧化还原抑制线粒体呼吸复合物Ⅰ的活性，引起线粒体膜电位改变[29]，进一步造成线粒体外膜上具有线粒体靶向结构域的蛋白激酶PINK1积累，触发了Parkin蛋白的招募和激活[9]，活化的Parkin蛋白则促进线粒体外膜蛋白的泛素化和降解[30-31]，最终导致受损线粒体的自噬清除。研究发现，在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中，Parkin蛋白对应激状态下的细胞有保护作用。细胞发生应激时，Parkin增加了NF-kB基本调节器(NF-kB essential modulator，NEMO)的线性泛素化，上调NF-kB信号转导表达；而NF-kB进一步上调人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中位于线粒体膜间隙的视神经萎缩1(optic atrophy 1，OPA1)的表达，进而维护线粒体完整性和保护应激诱导的细胞死亡，其中OPA1是线粒体嵴完整性的关键调控因子，可以调控细胞色素C的释放。另外，研究也发现Parkin蛋白可以通过NEMO诱导OPA1的表达和加工过程，阻止细胞色素C的释放[32],NEMO是IkB激酶的核心调控因子[33]。Henn等[34]发现,在NF-kB信号通路中，IkB的超阻遏物过表达时Parkin蛋白便不能再刺激NF-kB的转录；在IkB激酶信号小体水平，非活性的IKKβ突变体阻断了NF-kB信号通路的激活，说明Parkin蛋白可能作用在IKK复合物和(或)其上游成分，其神经保护作用也依赖于IKB激酶/NF-kB信号通路的激活。Sha等[35]研究发现，PINK1作用在Parkin蛋白的上游，也参与了IkB激酶/NF-kB信号通路增强Parkin蛋白介导的泛素信号参与的神经保护作用。此外，也有研究表明促凋亡因子P53的表达可被Parkin蛋白抑制[36]，说明在发生DQ中毒时，Parkin蛋白不仅可以通过调控线粒体自噬也可通过上调NF-kB表达及抑制P53因子表达发挥神经保护功能。

2.3 PINK1蛋白与NF-kB/P53信号通路在DQ中毒神经元损伤中的作用

Lim等[37]研究发现,在PINK1蛋白导入线粒体时，全长PINK1被一系列线粒体蛋白酶逐步修饰为53 kDa的裂解形态(PINK1-53)，PINK1-53不抑制Parkin介导的线粒体自噬，相反，它似乎触发Parkin转位到正常线粒体，促进线粒体自噬，引起自身的清除；在没有异位全长PINK1参与的情况下，通过进一步检测不被降解的PINK1截断突变体PINK1△104的表达发现，PINK1△104被肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)泛素化，TARF6是PINK1稳定的调节因子，也是NF-kB通路的传感器，说明NF-kB通路激活稳定了PINK1-53的表达，间接地稳定了线粒体自噬。而当DQ中毒时，NF-kB功能激活，P53基因表达上调。Goiran等[38]研究发现，P53基因通过抑制PINK1启动子活性及其蛋白和mRNA表达水平来控制其表达，揭示PINK1是第一个被P53转录抑制的促自噬基因，Parkin蛋白抑制P53基因的表达，他们通过实验进一步证实了P53对PINK1的调控与Parkin无关，同时发现Parkin也可以在PINK1上游作用，以调节其转录和促自噬功能。

3 PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬在DQ中毒神经元损伤中的治疗展望

PINK1/Parkin信号通路介导受损线粒体的自噬清除对于维持神经元正常功能是至关重要的，增强PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬可减轻神经元损伤。Lin等[39]研究表明,鼠草尾酸(carnosic acid，CA)通过激活PINK1/Parkin/线粒体自噬途径，可以保护SH-SY5Y细胞免受6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的线粒体损伤。具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳的红景天苷(Sal)通过增强PINK1和Parkin蛋白在线粒体上的表达，显著增加了线粒体自噬和自噬通量，在MPP+/MPTP诱导的PD模型中，Sal可能通过增强PINK1/Parkin蛋白介导的线粒体自噬而发挥神经保护作用[40]。顺铂是一种铂基化疗药物，暴露于顺铂下可诱导PC12神经细胞ROS生成增多，细胞线粒体膜电位下降，细胞ATP减少，显著降低神经元的长度和核直径，引起周围神经病变(peripheral neuropathy,CIPN)；通过建立体外顺铂诱导的神经毒性模型研究，表明PINK1/Parkin/线粒体自噬对顺铂诱导的PC12神经细胞线粒体功能障碍具有保护作用，Parkin蛋白过表达时显著增加了神经元的长度和核直径[41]。且最新研究发现白藜芦醇可增强肠线粒体中PINK1和Parkin水平，改善DQ所致的线粒体肿胀、空泡化和嵴破裂；而当白藜芦醇含量降低时ROS生成量增多、线粒体膜电位改变、空肠线粒体DNA含量及线粒体复合物Ⅰ-Ⅳ活性增加，表明在仔猪DQ中毒时，白藜芦醇在保护肠道屏障、改善氧化还原状态、减轻线粒体损伤和诱导线粒体自噬方面具有显著作用[42]。有研究[43-44]发现，三丁醇在DQ中毒的猪仔中可增加肠道线粒体自噬蛋白(PINK1和Parkin蛋白)的表达，降低了氧化应激和肠道炎症，诱导了线粒体自噬，改善线粒体功能，进而减轻神经功能障碍。因此在发生DQ中毒后，早期及时维持或增强PINK1及Parkin蛋白的表达对于神经细胞的保护是相当有意义的。

综上所述，神经保护蛋白PINK1/Parkin与DQ中毒神经元损伤之间通过NF-kB/P53信号通路以及线粒体自噬相互联系，DQ中毒后给予药物干预可以通过增加线粒体自噬蛋白PINK1和Parkin的表达改善线粒体功能，减轻神经元损伤。因此，临床上发生急性DQ中毒时，维持PINK1和Parkin蛋白表达，加强PINK1/Parkins信号通路调控的线粒体自噬将会是减轻DQ中毒神经元损伤的工作重点，也是我们的努力方向，期望能进一步明确DQ中毒神经损伤的机制，为DQ中毒神经损伤的治疗提供合理的理论依据。