脂肪干细胞分化为血管内皮细胞机制的研究进展

郭廷贤，陆无畏，郭芳芳

(东南大学附属中大医院 烧伤整形科，江苏 南京 210009)

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一种间充质干细胞，是从脂肪组织中分离得到的一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。已证实ADSCs可分化成多种细胞谱系，具备修复、维护或增强各种组织的潜力[1-2]。ADSCs来源丰富，分离、鉴定与培养较易操作，不存在应用胚胎干细胞时的伦理道德问题[3]。与其他干细胞比较，ADSCs在实际应用方面有着独特优势，是理想的血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)来源。创面修复状况会影响患者生活质量，一直是外科学中的热点问题。VECs能促进受损组织血运重建及受损器官功能恢复[4]，但其来源是临床应用的瓶颈。研究证实ADSCs在特定条件下可分化为VECs，将获得的细胞注入受损组织可加快创面修复[5]。

1 ADSCs与VECs的鉴定

1.1 ADSCs的鉴定

ADSCs与其他间充质干细胞一样均表达多向分化潜能细胞的标记分子，其功能的发挥在很大程度上依赖于表面表达的分子，同时这种表面标记分子也是鉴定细胞种类的重要标志。2013年，国际脂肪应用技术协会[6]宣布从人体中分离的ADSCs表型为CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而经体外培养的ADSCs表型为CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+。

1.2 VECs的鉴定

VECs作为形成血管壁的细胞，通过参与血管新生、分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)等血管舒张因子调节血管通透性，与血管中的成分相互作用在维持血管稳态中发挥极为重要的作用[7]。对于VECs的鉴定，国内外学者大都会从以下3方面[8-10]进行：(1) 形态学：镜下成熟VECs具有特征性的镶嵌状铺路石样形态。(2) 细胞表面标记：成熟VECs其表型为CD31、血管内皮生长因子受体-2(VEGF-R2)、VECs钙黏连蛋白(VE-Cadherin)表达阳性，同时胞浆内血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)染色阳性。(3) 细胞功能：成熟VECs应具备小管形成的能力，分泌NO，并摄取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)。

2 ADSCs分化为VECs的诱导方法

诱导ADSCs向VECs分化的方法虽然很多，但主要是培养基诱导培养、共培养以及基因转染3种方法。

2.1 培养基诱导培养

培养基诱导培养多采用直接诱导分化。Colazzo等[9]将培养至第3代ADSCs的培养基中添加50 ng·ml-1的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)来诱导分化，经过7 d的培养，有15%的细胞内皮标记物呈阳性，这些细胞也能够摄取ac-LDL，并在Matrigel成管实验中形成管状结构。刘琳等[10]在Colazzo等的实验基础上，加入了碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)进行联合诱导培养，经过21 d的培养，发现被诱导的ADSCs的细胞形态向VECs转化，呈铺路石样形态,VECs第Ⅷ因子相关抗原染色细胞阳性,透射电镜下可见W-P小体(Weibel-Palade body)。以上都表明在诱导ADSCs向VECs分化时，培养基添加细胞生长因子具有积极的作用。Shang等[11]在诱导ADSCs向VECs分化时，设计了在培养基添加VEGF和骨形成蛋白-4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)，并联合缺氧环境处理的诱导方法。结果表明，在添加VEGF的条件下，ADSCs就可以向VECs分化，但是分化率不高，而联用BMP-4的细胞组分化程度较高，分化的细胞数量也显著增加。值得注意的是，缺氧处理条件下的ADSCs不仅高度表达了VECs标记物，包括 CD31、VEGF-R2 和 VE-Cadherin，还显示出体外血管生成的潜力，可以摄取ac-LDL并具备体外分泌NO的能力。

研究均显示，在体外对ADSCs进行培养基定向诱导时VEGF是至关重要的，其作用促使ADSCs向VECs分化。但值得注意的是，当在培养基继续添加血管发生相关的其他细胞因子时，ADSCs分化为VECs的程度往往会升高，与此同时获得的VECs的数量也会增多[9-11]。

2.2 共培养体系诱导

焦自钊等[12]研究发现，将ADSCs和VECs以1∶1的比例在培养基上共培养，最终共培养上清液中VEGF、b-FGF浓度明显高于VECs单独培养组，同时ADSCs有明显的向VECs分化趋势，并具有VECs的形态,研究提示ADSCs可能通过直接分泌或间接作用来促进VECs分泌VEGF、b-FGF等细胞因子，进而影响VECs增殖及血管化，也改变了ADSCs的分化方向。最新研究中，石志康等[13]将兔的ADSCs和VECs共培养接触，结果可见体外培养扩增的ADSCs呈梭形生长，VECs形态多样，呈铺路石样。经免疫组化染色分析，发现ADSCs与VEC共培养组上清夜中VEGF、平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表达明显高于单独培养组,该研究提示我们ADSCs和VECs经体外共培养可作为种子细胞参与组织工程用于增加组织血管的生成。

在这些共培养的研究中均发现共培养上清液可以检测到VEGF的表达增加，ADSCs可以向VECs分化。

2.3 基因转染定向诱导

关于使用基因转染技术来进行定向诱导的方法，李江璇等[14]通过将携带 VEGF基因的慢病毒表达载体转染于人ADSCs,检测其培养基上清液中细胞生长因子的表达，结果显示转染VEGF基因后的人ADSCs可以分泌VEGF和b-FGF，培养基的上清液也可以提高VECs的增殖活力和迁移能力。同时还有研究者[15]将含有血小板衍生内皮生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)基因的慢病毒表达载体转染于兔ADSCs，同时设置对照组，注入皮下观察ADSCs的形态和其表达蛋白，结果显示转染了PDGF基因的ADSCs表达PDGF的数量明显增加，同时皮下新生血管数量明显增加，说明基因转染的方法可促进ADSCs分泌细胞因子，同时促进ADSCs向VECs分化。

以上研究说明ADSCs具有向VECs分化的潜力，是VECs体外来源的理想途径，诱导过程中VEGF尤为重要。只有对分化机制进行深入研究和探索，才能获得高分化度、高成熟度、高转化率的血管内皮种子细胞，进而为组织工程血管构建提供研究基础。

3 ADSCs分化为VECs的相关机制

对诱导ADSCs向VECs分化机制的研究很多，近期研究主要涉及调节细胞表面蛋白受体、通过细胞携带外泌体和影响细胞信号转导通路3个方面。

3.1 通过调节ADSCs表面酪氨酸激酶受体来影响分化方向

Mustonen等[16]研究发现，成熟VECs表面有3类主要的酪氨酸激酶受体及其配体家族(VEGF/VEGFR、Ang/Tie、Ephrin/Eph)，其在血管的生成中起到了相当重要的作用。Cheng等[17]研究发现，Eph的受体酪氨酸激酶的活化,在VEGF依赖的血管生成中具有重要作用，该实验结果还显示:(1) VEGF能诱导血管内皮上酪氨酸激酶受体EphrinA的表达和内源性EphA2受体活化磷酸化；(2)如果阻滞EphA受体的活性，会抑制VEGF依赖的血管形成。同时还有研究显示,EphB的配体EphrinB2能抑制VEGF和血管生成素(angiopoietin-1，Ang-1)诱导的RAS/MAPK信号途径,从而抑制VEGF和Ang-1诱导的动脉处VECs增殖和迁移[18]，这对动静脉交界处毛细血管内皮正确的形态学发生是极为重要的因素。Shang等[11]成功诱导ADSCs向VECs分化，其潜在机制就是在低氧环境下EphrinB2的去甲基化，影响了后续相关的蛋白合成信号通路，促进了ADSCs向VECs的分化，可以进一步认为，影响ADSCs表面受体酪氨酸激酶的活性，可以定向促进ADSCs向VECs分化。

3.2 通过ADSCs外泌体携带物质来影响分化方向

外泌体是细胞胞膜系统通过主动分泌排出的一种直径40～150 nm的盘状小囊泡，同时外泌体具有和其来源细胞相同的生物学功能[19-20]。研究显示，不同来源的外泌体其合成分泌的RNA具有不同的结构,产生特定的生物调控信息,从而影响机体生理过程[21-22]。张静等[23]将收集到的ADSCs外泌体注入人脐静脉VECs的培养液中，发现实验组的细胞培养液中VEGF蛋白表达量明显高于对照组；体外Matrigel成管实验中，发现实验组形成管状结构明显增多，提示ADSCs外泌体可以促进血管内皮的增殖、迁移及管样结构形成。而张亚等[24]研究ADSCs分化成VECs前后ADSCs外泌体携带的mi-RNA的差异性表达，发现了数个mi-RNA通过调控与干细胞的分化、细胞增殖和细胞周期调控、生长因子、转录因子、跨膜蛋白、结合蛋白等息息相关的靶基因，从而参与调控人ADSCs向VECs的分化过程。

以上研究表明，ADSCs外泌体携带的不同mi-RNA，通过影响后续相关靶基因的表达，可以诱导ADSCs向VECs分化，例如一项来自国外学者的研究就表明诱导前后ADSCs外泌体携带的mi-RNA的差异性表达，可以介导靶基因EphrinB2调控VEGF依赖的血管生成，同时可调节纤溶酶和基质金属酶两种蛋白的活性来调控ADSCs向VECs分化[25]。

3.3 通过影响ADSCs信号转导通路来影响分化方向

许多研究表明，ADSCs具有多向分化的潜能，通过多种信号通路介导ADSCs可以分化为多种不同的细胞，主要包括成骨细胞、软骨细胞、神经元、平滑肌细胞、淋巴管内皮细胞等[26-30]，同时具有向VECs分化的能力。Hellstrom等[31]研究显示，VEGF信号通路的下游通路Dll4/Notch信号通路在调控新生血管形成上具有极其重要的意义，这也是VEGF在血管发生中发挥重要作用的基础。而Kim等[32]也发现，BMP信号通路的下游通路Alk1-BMPRII / ActRII-ID1 / ID3通路在血管新生中起到了重要的调控作用，这也是Shang等[11]在诱导ADSCs向VECs分化时联合使用VEGF和BMP-4的实验基础。殷令妮等[33]研究发现，低氧培养不仅可以刺激ADSCs增殖，还可以促进ADSCs向VECs分化，此过程是由PI3K/Akt信号通路介导发生，此通路还介导多种细胞因子如VEGF、PDGF的产生，进而促进ADSCs向VECs分化。

4 ADSCs定向分化为VECs的应用现状

近些年来，随着人们对于诱导ADSCs向VECs转化的研究深入，ADSCs越来越多地被应用在血管组织工程之中。Volz等[34]研究认为，如何应对重度烧伤创面修复、畸形矫正术后和肿瘤切除术后的受损软组织的替代，成为临床上一个棘手的问题。尽管目前外科手术技术的不断革新和诸多新型合成材料的应用在一定程度上缓解了这一情况，但在供体和受体部位的实际应用中仍存在大量局限性和并发症，影响预后质量，因此迫切需要开发出新的方法以及材料允许永久替代自身软组织[35]。ADSCs的诱导分化作为血管化脂肪组织工程的基本工具，应用其开发安全、高效的体外脂肪组织构建物成为了当今的技术热点，尤其是脂肪组织工程血管化，在血管组织工程中具有更重要的地位。Kayabolen 等[36]开发出了一个具有良好机械性能的生物相容性的水凝胶支架，将脱细胞脂肪组织(decellularized adipose tissue，DAT)和纤维蛋白(Fibroin，Fib)以1∶3的比例混合制备水凝胶，该水凝胶支架是具有良好的支持VECs生存的脂肪组织构建物。Park等[37]在实验中发现ADSCs引起的三维细胞团(three dimensional cell masses，3DCMs)发生了缺氧状况，加速了VEGF的表达，促进了新生血管的生成，说明ADSCs的3DCMs可以用作新血管形成的VECs来源，也可以与其他细胞类型共同植入进行再生医学研究。

目前来说，血管化脂肪组织工程是一个非常有前景的领域，期待着我们寻找到新的可诱导ADSCs分化为VECs的靶点，或者构建新的模型来进行血管组织工程。不过我们仍应当意识到，尽管ADSCs分化被视为再生医学中新的干细胞疗法的工具钥匙，但仍需综合宿主环境和患者相关因素，通过进一步研究以提高其效率及可应用性[38]。

5 展 望

ADSCs在促进创面愈合方面存有巨大潜力，尤其是血管脂肪组织工程化更是具有非常大的发展前景。但如何寻找到一个新的靶点，以及怎样通过最新技术构建一个高效安全可利用的模型都是非常值得探索的。相信在不久的未来，随着血管组织工程理论的不断完善，我们可以结合最新的科学技术制作出应用于受损组织的安全、高性能的再生血管替代材料。