小麦中呕吐毒素检测方法的研究

□ 王 宠 贾立玮 焦 玲 吕朝辉 郭晓姗 天水市粮油防治检验中心

呕吐毒素为镰刀菌属次级代谢产物，人体大量摄入会产生剧烈呕吐反应，引起神经紊乱等中毒现象，呕吐毒素曾在加拿大和中国引发了两场较大的肠胃疾病风暴[1]，其危害已逐渐被人们所认识，我国老百姓将它污染的小麦叫做病麦或毒麦。欧盟规定未加工硬质小麦呕吐毒素最高限量为 1 750μg/kg[2]，我国国家标准规定小麦中呕吐毒素不得超过1 000μg/kg[3]。因此,小麦中呕吐毒素的检测方法是近年来研究的热点和难点。本文对小麦中呕吐毒素的4种检测方法及其优缺点进行阐述，即酶联免疫筛查法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）、胶体金快速定量法、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）、液相色谱质谱联用仪法，期望检测机构对小麦中呕吐毒素检测方法选择、准确度计算以及成本估算提供依据。

1 小麦中呕吐毒素检测方法

1.1 酶联免疫筛查法

称取一定量的小麦样品经水提取，过滤或离心获取上清液，与酶标板微孔中的呕吐毒素进行酶联偶合后再与试样上清液或标准品中的竞争性微孔的预包被的特异性抗体相结合，洗涤后加入相应的显色剂显色，加无机酸终止反应后在450 nm或630 nm波长下检测，被测物浓度与吸光度在一定范围内呈反比。此法为我国国家标准小麦中呕吐毒素检测第4法。

1.2 胶体金快速定量法

胶体金快速定量法的基本原理是免疫层析法。利用水提取样品中的呕吐毒素，得到的提取物质将和带有颜色的微粒反应。在规定的时间内用读数仪读取检测区域内颜色的强度，最终换算得到检测结果[4]。

1.3 液相色谱法

称取25 g粉碎后的小麦样品于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇和100 mL水混合均匀，提取 20 min过滤后通过免疫亲和柱净化，用高效液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量评估。此方法为我国国家标准小麦中呕吐毒素检测第二法。

1.4 液相色谱质谱联用仪法

称取5 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL提取液提取30 min，取 0.5 mL离心后的上清液与水1∶1稀释混合均匀，过滤上机检测[5]。此法已作为粮食行业标准且在粮油检测中广泛应用。

2 小麦中呕吐毒素检测的4种方法优缺点

2.1 酶联免疫筛查法

优点：样品不需要净化；检验程序简单且速度较快；提取液为水，成本较低；酶标检测仪购置价格较低，一般检测机构可接受[6]。ELISA法回收率在75%～125%，检出限为 200 μg/kg，定量限为250 μg/kg。针对大量小麦样品快速筛选时，此方法易操作、灵敏度高、等待结果的时间短，适用性更强。

缺点：每一批次检测操作人员必须直接接触高浓度呕吐毒素标准品（最高浓度可达2 000 μg/kg），这对检验人员的专业水平及实验操作环境要求较高。目前市售试剂盒有48孔及96孔，批量检测需消耗10～12个微孔做标准曲线，其余84～86个微孔可用来检测样品，虽然批量检测成本低，但单个样品的检测也需占用微孔做标准曲线，因此试剂盒消耗较大，成本较高。

2.2 胶体金快速定量法

优点：与其他检测方法相比，胶体金快速定量法速度更快、对检测人员的专业化水平要求相对较低、检测结果的精准度也为人们所接受、检测仪器能够直接携带到小麦收购现场。检测过程中检测人员不需直接接触呕吐毒素标准品，对人员及实验室环境要求相对较低。李培真[7]等用胶体金测试条快速定量法检测粮食中呕吐毒素时，从样品处理到读数，15 min即可完成一个样品的测定。因此胶体金快速定量检测法在收购小麦的实际操作过程中,更受工作人员的青睐。

缺点：朱云等[8]在研究中发现，当呕吐毒素浓度小于1 500 μg/kg时，胶体金检测技术与液相色谱法有良好的线性关系，当浓度增大时，两种方法的检测结果相差较大。

2.3 高效液相色谱法

优点：我国国家标准中高效液相色谱法的检出限为100 μg/kg,定量限 为200 μg/kg[9]。王 俊 双[10]利 用HPLC法经同一样本多次重复测定，检测相对标准偏差RSD为1.53%，因此HPLC法对呕吐毒素的检测精密度较高，回收率在70%～90%。研究表明，HPLC法测定小麦中呕吐毒素含量的不确定度为71 μg/kg[11]。针对少量小麦样品质量的高精度检测时，选择HPLC法更为适宜，其检测结果误差较小。必要情况下，联合应用ELISA法和HPLC法，既能弥补单一检测方法的不足之处，又能得出准确的检测结果。

缺点：HPLC法检测步骤烦琐；提取所用的有机试剂及净化所用的免疫亲和柱成本高；经过免疫亲和柱处理得到的检测结果时间较长；受不同厂家免疫亲和柱柱容量影响，检测高浓度样本时需要增加稀释倍数，这对操作人员的专业水平要求较高；HPLC法上机检测前的氮吹环节对实验室标准更高。

2.4 液相色谱质谱联用仪法

优点：前处理操作简单，耗时较少且一次可同时检测多种真菌毒素，灵敏度较高，选择性强，其检出限 为0.3～60.0 μg/kg,定量限 为1.0～200.0 μg/kg。

缺点：液质联用仪购置价格昂贵，一般配置价格需要100万元以上，较高配置可达200万～300万；稳定同位素内标价格较高，对检测机构的成本压力较大，大多基层实验室无法实现。

3 结语

近年来，基于小麦中呕吐毒素检测的研究方法较多，但是操作简单的检测方法在灵敏度、准确度上还有一定的差距。准确度较高的方法操作过程复杂，需要的仪器设备价格较高，在基层实验室无法全面普及。

小麦在田间和储藏过程中会受到不同种类真菌的污染，产生的真菌毒素种类较多，常见的有呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等，因此，小麦在自然情况下可能含有多种真菌毒素，需要使用几种检测方法进行多次实验才能得到不同真菌毒素的含量。目前，急需研究一种能同时检测小麦中多种真菌毒素的检测方法，以便能够实现小麦中多组份真菌毒素地快速筛查、准确定性和精准定量检测，提高检验检测效率，降低检验检测成本，为基层实验室以及小麦收获、入库等环节提供快速、准确检测结果的方法，便于在实际操作中推广。