挥发性有机化合物在肿瘤早期筛查中的研究进展

董国璋综述，许 林审校

0 引 言

癌症是世界上第二大死亡原因，到2030年，估计死亡人数将增加1310万[1]，其特征在于细胞不受控制的增殖，并且可在身体任何部位发育。我国目前已经成为肿瘤发病率和病死率第一的国家[2]，并且肿瘤的发病率和病死率仍在逐渐增长。尽管目前肿瘤的治疗方法在手术治疗、靶向治疗、免疫治疗等领域取得了诸多进展，但是肿瘤的生存率改善仍然有限，5年生存率依旧不高。因为大部分的肿瘤患者在确诊时已经处于中晚期或已经发生了远处转移。因此，如果能较早发现肿瘤并进行治疗干预，将会提高患者的5年生存率。

挥发性有机物(volatile organic compounds，VOCs)是指常温下以蒸汽形式存在于空气中的一类有机物，美国环境保护委员会将蒸气压小于0.1 mmHg设定为VOCs的判定标准。人体内VOCs可根据来源分为内源性和外源性的VOCs[3]。内源性的VOCs主要由细胞的基础功能如维持细胞膜完整性、能量代谢、氧化应激等过程产生[4]。外源性的VOCs主要存在于呼气中，这些VOCs从外界吸入并且同内源性的VOCs一起呼出。挥发性有机化合物是细胞代谢的最终产物，可能是由于癌细胞的基因或蛋白质改变导致细胞膜氧化应激或过氧化而产生的。挥发性有机碳可反映任何因炎症、坏死、癌症退化、微生物区系改变而引起的代谢变化，也可与环境污染、药物和饮食[5]等外部因素有关。这些代谢物被释放到血液中，在体内的任何地方产生，均会到达肺泡、肾小管和消化道中。在过去的二十年里，VOCs检测已经应用于各种临床场景。本文将对各种挥发性有机物分析在肿瘤中的研究现状作一综述。

1 挥发性有机物检测方法

1.1 GC-MSGC-MS是目前应用最为广泛的挥发性有机物检测方法。1971年，Pauling等[6]率先对代谢物的挥发性部分进行了分析，使用气相色谱-质谱仪(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)描述了人类呼气和尿液中约250种挥发性有机化合物的存在。1985年Gordon等[7]首次使用GC-MS测定了肺癌患者呼气中VOCs。自此，VOCs分析在癌症检测的临床潜力引起了人们的兴趣，最近30年来发表的论文数量迅速增加也有力证明了这一点。同时，不仅是肺癌，在很多其他癌种中GC-MS测定VOCs都表现出了不错的效果。GC-MS可对样品中的挥发性分子进行物理分离，并随后对其性质和数量进行鉴定，以确定被分析样品的确切组成。通过提供有关样本成分的定性和定量信息，这种分析技术可识别与健康对照组相比的肿瘤患者的代谢特征。目前，关于GC-MS测定VOCs的临床研究已经在陆续开展，这些研究大多采用病例对照的方法。选择肿瘤患者为病例组，非临床诊断为肿瘤的健康患者为对照组，比较2组患者收集的VOC谱。如果一种已鉴定的挥发性有机化合物的浓度在这2组之间有统计学上的不同，该化合物就被认为是一个生物标志物。这些研究确定的肿瘤生物标志物在很大程度上是不一致的，且在各个癌种中的生物标志物也是各不相同。

尽管GC-MS具有效率高的优点，但其成本高、可管理性差等，限制了其在大规模筛查中的常规应用。此外其在分析过程中尚未形成标准化的检测方法，导致VOCs检测受气体收集方法、设备、方法的敏感性及检测环境等多个方面影响，其重复性和稳定性有待进一步验证。

1.2 选择离子流动管质谱法(selected Ion flow tube mass spectrometry, SIFT-MS)SIFT-MS是一种定量质谱仪技术，可实时测量潮湿空气样品中微量气体分子的浓度。1999年Spanel等[8]首次利用该方法对膀胱癌和前列腺癌患者尿液中的甲醛进行测定。之后也有很多文献报道使用该方法对于胃食管癌[9]、结直肠癌[10]、肺癌[11]等样品的VOCs进行检测，其结果同样具有统计学意义。SIFT-MS在高通量和实时分析气体样本中的VOCs显示出了巨大的潜力，不过由于其工作原理及零件构成使得其成本较高，仪器体积较大，且在呼气样本以外的应用较罕见。

1.3 电子鼻技术及其他检测方法电子鼻技术是一系列化学传感器以及特定的识别方法组合而成的仪器，该传感器能够在化学类别的VOC存在的情况下产生电响应，给出定性的响应，而非特定响应。因此电子鼻不能识别单一挥发性有机化合物，但就像人类嗅觉一样，其可检测不同化学类别的组合，如烷烃、酒精和芳香化合物[12]。电子鼻技术比GC-MS更快、更易操作，可通过模式识别来识别特定的状态。该方法简便，易携，在早期肿瘤的筛查中具有很大潜力。其他检测方法如质子转移反应质谱法[13]、离子迁移质谱法[14]等报道较少，其灵敏度及特异性需要进一步进行临床研究验证。

2 不同样本中的挥发性有机物

2.1 呼出气呼出气样本由于其收集方便，易于存储等优势，成为了最早应用于VOCs检测的样本。其在肺癌、胃食管癌、结直肠癌、乳腺癌等中均有应用。

呼出气VOCs用于肺癌诊断及筛查的研究进行的最多也最早。有研究分析了12例肺癌患者及健康对照者之间不同的质谱峰值分析图，从而提出呼出气体中的28种有机化合物可作为候选的肺癌标志性气体成分[7，15]，这一发现提示了VOCs在肺癌筛查中的巨大潜力。此后在肺癌患者的呼吸中也发现了邻甲苯胺，苯胺和脂质过氧化活性的改变[16-17]。Michael Phillips是呼吸研究领域的先驱之一，利用GC-MS进行了三项独立的肺癌生物标记物发现研究[18-20]，鉴于这些研究得出的生物标志物各不相同，但主要的生物标志物主要是烷烃衍生物，这在其所有三项研究中都是一致的。与健康对照组相比，肺癌参与者中大多数VOCs的相对丰度降低；这种差异可能归因于肺癌中CYP450基因激活导致脂质过氧化产物分解增加[21]。然而，还有许多其他研究表明烷烃与肺癌无关[21-23]。这些研究均未评估检测到的VOCs的来源。事实上，大多数挥发性有机物在呼气中的作用机制仍不清楚。Hakim等[24]总结了肺癌相关挥发性有机化合物可能的生化途径。目前尚无一致且有效的肺癌VOCs生物标志物的报道。造成这些不一致的原因是多方面的，不同的研究在呼吸采样程序、研究设计(对照组的选择、患者的选择等)和数据分析方法方面有很大的差异。

近些年，其他肿瘤患者的呼出气研究也相继出现。Peng等[5]发表了首次使用定制的纳米传感器阵列对肿瘤患者进行代谢性呼气分析，该阵列基于有机功能化的金纳米颗粒(gold nanoparticles，GNPs)和SPME-GC-MS分析，以确定合适的代表性VOCs来区分这些类型的癌症。呼吸样本来自26例结肠癌患者、30例肺癌患者、22例乳腺癌患者、18例前列腺癌患者和22例健康对照。GNP阵列在区分结肠癌患者和健康对照方面显示出很高的鉴别能力。2013年，Altomare等[25]利用TD-GC-MS分析了37例结肠癌患者和41例健康对照的呼吸样本，识别出15种VOC模式，其灵敏度为86%，特异度为83%，准确率为85%，ROC曲线下面积(AUC)为0.85%。呼出的VOC模式的辨别能力随后在另一系列25名受试者的盲目阶段进行了验证，准确率为76%[26]。2015年Kumar等[27]分析了81例食管(n=48)或胃腺癌(n=33)和129例包括Barrett上皮化生(n=16)，良性上消化道疾病(n=62)或正常的患者的呼气样本(n=51)。筛选出了十二种VOCs(戊酸，己酸，苯酚，甲基苯酚，乙基苯酚，丁醛，戊醛，己醛，庚醛，辛酸，壬醛和癸醛)的浓度显着高于癌旁组(P<0.05)。Chen等[28]更进一步发现了可通过呼出气VOCs检测来不仅能将胃癌病人与正常人区分开来，同时也可区分出早期胃癌和晚期胃癌，使VOCs检测肿瘤更为精确，为临床病情评估提供了更为精确的依据。

2.2 尿液尿液中含有高浓度的挥发性代谢物，且收集和存储较为方便，使其成为挥发性有机化合物分析的另一个极具吸引力的目标。Silva等[29]用动态固相微萃取(DHS-SPME)结合GC-MS评价了肿瘤患者和健康对照组中尿VOCs谱的差异。肿瘤组包括14例白血病患者、12例结直肠癌患者和7例淋巴瘤患者，并与21例健康对照组进行比较。在对照组和肿瘤学组中共鉴定出82种不同化学类别的挥发性代谢物。其中苯类衍生物，萜类化合物和苯酚在肿瘤患者组中最常见，而酮和硫化合物在健康受试者尿液中含量更多。结果表明在尿液中，肿瘤患者和健康志愿者之间的VOCs浓度有着显著差异。

另外，在英国考文垂和沃里克郡的大学医院进行过两项研究。第一项研究使用FAIMS仪器和Combi-PAL ITEX自动预浓缩系统，结合从83例结肠癌患者和50例健康对照获得的GC-MS来评估尿样[30]。该研究结肠癌组于健康对照组两组之间的敏感性为88%，特异性为60%。在第二项研究中，作者开发了一种专用电子鼻系统，该系统由13个传感器组成，测试了该系统对92份尿样(包括39例结肠癌患者、35例肠易激综合征患者和18例健康对照)尿液中的VOCs。与其他两组相比，该研究检测结直肠癌的灵敏度为78%，特异度为79%[31]。近些年来，尿液也被应用于胰腺癌和前列腺癌的无创诊断[32-33]。各种研究均证实了肿瘤患者尿样中可识别的代谢紊乱的存在，以及尿液作为一种潜在的易于获得的生物样本进行筛查的有效性。

2.3 其他对于VOCs的研究不仅只局限于呼出气和尿液。很多学者在其他样本，如粪便、胆汁等中同样做出了尝试。2014年De等[34]首次报道了粪便样本分析经验，监测了40例结肠癌患者、60例晚期结肠腺瘤患者和57例健康对照。对35例结肠癌、46例晚期腺瘤和52例对照组的粪便标本进行检测。在结直肠癌患者和对照组的比较中显示出85%和87%的灵敏度和特异度。将晚期腺瘤患者与对照组进行比较，其敏感度为62%，特异度为86%。对结直肠癌和晚期腺瘤患者进行比较，敏感性为75%，特异性为73%。Batty等[10]通过 SIFT-MS分析筛选出了粪便中3种可能的结肠癌生物标志物硫化氢、二甲基硫化物和二甲基二硫化物。有研究首次使用胆汁作为样本,分别筛选出了胰腺癌和胆管癌可能的生物标志物(乙醇，丙烯腈，乙腈，乙醛，苯，二硫化碳，二甲基硫，2-普萘洛尔)，并且采用机器学习等方法建立筛选模型，使检测结果敏感性和特异性显著增高(敏感性为93.5%，特异性为100%)[35-37]。

3 结语与展望

VOCs检测用于癌症的早期筛查和诊断是一个迅速发展的领域。各项证据表明，肿瘤的发生发展中存在代谢组学的紊乱，并且可通过呼气、尿液、粪便等多种方法检测出来。VOCs作为肿瘤的“气味印记”，表现出了相当不错的潜力。这种“气味印记”可通过不同分析平台和基质来进行评估，并且可以无创而有效的实现肿瘤的早期筛查和早期诊断。但是由于缺乏标准化的实验流程，至今无统一评估标准。尽管已经基本确定最常见的代谢化学物为烷烃和芳香族化合物，但各个研究之间差异仍然较大，较难形成统一的结果。

为了使VOCs能够进一步转化为临床广泛使用的生物标志物，需要再以下三个关键领域取得进展：①开发标准化和灵活的气体样本采集方案；②经过仔细的研究设计和外部验证的纵向多中心临床试验；③对于肿瘤发生发展过程中所涉及的生化途径进一步探究，直接证明VOCs的生化来源。我们相信，这些发现最终将有助于VOCs检测成为一种肿瘤早期筛查和早期诊断技术的发展，使VOCs检测能够实现其发展潜力，并成为个性化医学诊疗中的关键工具。