外泌体源性miRNAs在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

翟玉红 杨 俊 杨 简 张 静 李 奇 郑 涛 范致星

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 心血管内科 & 三峡大学 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是目前人类死亡和致残的主要原因，及时行再灌注治疗(如经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术和早期溶栓等)是挽救AMI患者最有效的方法。但是，再灌注治疗的同时常伴随心肌顿抑、再灌注心律失常、微血管功能障碍等一系列心脏相关不良事件发生，造成心肌损伤进一步加重，这一现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。外泌体是细胞内多囊体与质膜融合后释放至细胞外的囊泡样小体，具有独特的生物学特性，通过转运miRNAs、circRNAs、mRNAs、DNAs和脂质等生物分子成为细胞间通讯的重要介质[2]。新近研究发现，心血管病患者外泌体miRNAs差异性表达可操控多种基因的转录和翻译，干预炎症反应、细胞增殖、凋亡等病理生理过程，逐渐成为心血管疾病治疗的关键靶点[3]。本文就外泌体源性miRNAs在MIRI发病机制中的研究进展进行归纳总结。

1 外泌体miRNAs

1.1 外泌体miRNAs的结构及功能

外泌体是直径为30～150 nm，由各种类型的真核细胞释放到血液、脑脊液、唾液、胆汁等细胞外液中的杯状脂质双层膜泡，通过传递蛋白质、糖、脂类、mRNAs、miRNAs和lncRNAs形成巨大的通讯网络，参与包括发育、免疫、组织稳态、肿瘤和神经退行性疾病的调节[4]。深入研究发现，外泌体中含有大量miRNAs，其中异质性胞核核糖核蛋白A2B1和KRAS基因在外泌体选择性富集miRNs的过程中发挥关键作用[5]。外泌体miRNAs是一类内生的、长度约为22个核苷酸的非编码单链小分子RNAs，是调控基因转录后的主要因子，在外泌体介导的细胞间通讯中有着十分重要的意义[6]。外泌体通过质膜融合、细胞胞饮以及特异性受体依赖途径将miRNAs转运、释放至靶细胞，随后miRNAs以完全或不完全配对方式结合至靶mRNAs的3’非编码区和/或5’非编码区及开放阅读框参与调节基因表达，其中，由2～7个核苷酸组成“miRNA种子序列”是影响功能靶点的重要因素[7, 8]。外泌体miRNAs的主要功能是参与靶基因水平的负向调控，单个miRNA可以调节多个靶基因位点，同时单个mRNA也可被多个miRNAs调控。如果miRNAs与靶mRNAs完全匹配，导致靶mRNAs降解；反之，则会抑制靶基因翻译[9]。此外，部分外泌体miRNAs还具有与toll样受体结合，激活免疫细胞的能力[10]。

1.2 外泌体miRNAs的生物学特性

外泌体的磷脂双分子膜结构使外泌体miRNAs在细胞外液中高度稳定且易于检测，将外泌体置于4℃储存96 h或在-70℃储存1个月后，外泌体miRNAs的表达谱仍未发生明显的改变[11]。外泌体广泛参与器官/组织间信号通路交叉串扰，其中miRNAs的表达水平与细胞功能紊乱密切相关。由于泛素、转运必需内体分选复合物、Y-box蛋白27等调节蛋白的存在，患者和正常个体中的外泌体miRNAs含量存在显著差异[12, 13]。当机体受到损伤时，组织中特异性外泌体miRNAs释放入外周血循环，致使血浆中miRNAs的表达谱发生改变。值得注意的是，其变化常出现在某些疾病的早期阶段，相比常规检查具有更高的敏感性和特异性，并且这些miRNAs可通过多种机制改变靶细胞的活性，发挥生物学效应[14]。富集血浆外泌体进行分离和鉴定发现，AMI后大量miRNAs的表达水平升高；其中miR-21、miR-26和miR-328主要参与心脏重构；心肌细胞特异性外泌体miR-208a则随细胞凋亡程度发生动态改变[15]。Pan等[16]在研究肥胖症小鼠体内脂肪细胞炎症反应和胰岛素抵抗的分子机制时，发现脂肪细胞分泌的外泌体miR-34a以旁分泌的方式进入巨噬细胞，靶向调节KLF4转录，抑制M2巨噬细胞极化，从而成为调控炎症反应的重要介质。同时，胰腺β细胞来源的外泌体miR-15a可直接与视网膜细胞Akt3基因的3’非编码区结合，通过抑制PI3K途径减少细胞中活性氧的积累[17]。小胶质细胞来源的外泌体miR-124-3p是靶向下调FIP200介导的细胞自噬，减轻创伤性脑损伤的重要靶点[18]。因此，外泌体miRNAs通过不同路径参与疾病的发生发展，可能在MIRI病变中起到重要的作用。

2 外泌体miRNAs在MIRI中的研究

近年来，大量研究表明，外泌体miRNAs通过自分泌、旁分泌、远距分泌的方式，参与调控MIRI过程中凋亡、炎症、自噬、氧化应激、线粒体功能障碍等多种病理反应，发挥积极的保护作用，成为心血管领域研究的重点[19, 20]。

2.1 外泌体miRNAs与细胞死亡

自噬和凋亡是缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)诱导损伤细胞死亡的主要途径，并在心脏损伤病理演变过程中占有重要地位。减少I/R诱导的心肌细胞死亡和心功能障碍是改善MIRI的有效方法[21]。运动训练是降低心脏疾病风险、提供心血管保护的有利因素。Hou等[22]鉴定出运动训练衍生的血浆外泌体中部分miRNAs的表达上调，随后在缺氧复氧(hypoxia reoxygenation，H/R)模型中评估这部分miRNAs对心肌细胞功能的影响，发现miR-342-5p可以显著降低caspase9和JNK2蛋白水平，抑制LDH的释放，从而减少心肌细胞凋亡，增加细胞活力。Chen等[23]研究表明，当发生MIRI时，缺氧诱导因子-1α促进心肌细胞释放大量外泌体miR-30a，通过抑制自噬相关蛋白Beclin-1和Atg12的活性来减少心肌细胞死亡。然而，Xu等[24]使用外泌体miR-30a抑制剂处理I/R大鼠时发现，miR-30a抑制剂能显著降低ULK1和Beclin-1的蛋白水平，通过减少自噬抑制心肌凋亡。上述研究提示，外泌体miRNAs的来源可能是影响缺血再灌注损伤的重要因素。

研究表明，成人心肌细胞的增殖和自我修复能力有限，干细胞移植治疗成为心脏修复和再生的新趋势[25]。干细胞来源的外泌体作为细胞间信息交流的载体，具有低免疫原性、高稳定性和良好的生物相容性，且外泌体携带的miRNAs可直接到达心脏表面，发挥保护作用，成为干细胞治疗MIRI的重要方式[26, 27]。Wang等[28]将诱导多能干细胞来源的外泌体通过心肌注射的方式递送至AMI小鼠的局部缺血区域，随后再灌注24 h，发现心肌细胞高度富集外泌体源心肌保护性miR-21和miR-210，从而表现出低caspase3活性。同时，Li等[29]发现骨髓间充质干细胞来源的外泌体富含miR-29c，将外泌体通过心尖注射处理I/R大鼠，发现外泌体miR-29c通过抑制PTEN基因表达和激活AKT/mTOR信号通路，降低过度自噬导致的再灌注心肌损伤。

2.2 外泌体miRNAs与炎症反应

炎症反应对延缓疾病发展具有重要意义，巨噬细胞极化在I/R组织炎症损伤和修复进程中扮演重要角色[30]。Dai等[31]发现M2型巨噬细胞来源的外泌体能提高H/R乳鼠心肌细胞存活率，维持细胞膜的完整性。同时，微阵列分析提示M2型巨噬细胞外泌体是导致乳鼠心肌细胞miR-148a表达水平升高的主要原因，miR-148a可下调硫氧还蛋白互作蛋白表达，干预TLR4/NF-κB信号通路，进而抑制NLRP3炎症小体激活。Wei等[32]利用miR-181a的免疫抑制效应和干细胞源性外泌体与细胞靶向结合的能力，将过表达miRNA-181a的间充质干细胞源性外泌体注射到I/R小鼠的心肌组织，发现miRNA-181a可下调c-Fos蛋白水平，限制树突状细胞迁移，促进外周血单个核细胞Treg极化，减轻MIRI炎症反应。

2.3 外泌体miRNAs与氧化应激

氧化应激与miRNAs之间的相互作用是维持细胞稳态的重要方式，同时，这种复杂的调节网络在I/R中也发挥着重要作用。已有研究报道，miR-150和miR-21参与调控氧化应激介导的MIRI[33]。缺血预处理导致血浆中外泌体miR-21表达水平明显上升，Wen等[34]发现外泌体miR-21可显著减少过氧化氢处理的H9C2细胞凋亡和大鼠MIRI，由此证明外泌体miR-21参与心肌I/R过程中的氧化应激反应。Wang等[35]分别在过氧化氢和氯化钴诱导的H9C2细胞急性H/R模型中发现，外泌体miR-126与 ErbB受体反馈抑制物1靶向结合，减少心肌细胞内活性氧的积累，通过清除氧自由基和稳定线粒体膜电位来抑制心肌细胞氧化应激。

2.4 外泌体miRNAs的其他作用机制

多种机制贯穿MIRI的全过程，外泌体miRNAs传递信息的同时也参与了组织修复、心室重塑和血管生成的调节。其中血管的快速再生是延长受损心肌存活的关键。在健康志愿者和缺血性心脏病患者血浆外泌体miRNAs调控内皮细胞功能的研究中，Li等[36]发现缺血诱导的血浆外泌体miR-939-5p下调，可减轻对iNOS活性和内皮NO产生的抑制，最终促进血管新生。应用大鼠I/R模型，结合主成分分析算法和偏最小二乘回归方法评估婴幼儿心脏祖细胞外泌体miRNAs的作用，结果显示心脏祖细胞外泌体中miR-29c、miR-96、miR-182和miR-185参与改善梗死区域周边心肌肥大及心肌纤维化程度，miR-27a可促进血管再生，miR -138和miR-25则参与减少心肌细胞凋亡[37]。Emanueli等[38]发现，接受冠状动脉旁路移植术的急性心梗患者，心脏会释放大量外泌体miR-210，miR-133a/b至血液循环，触发组织适应性修复。

3 展望和总结

外泌体miRNAs在心血管领域具有广泛的应用前景，干细胞是其主要的来源之一。同时，研究表明，高通量电刺激预处理干细胞是一种优化外泌体miRNAs心脏修复功能的有效方式[39]。人工体外合成外泌体miRNAs也是一种治疗缺血性心脏疾病的有效策略。miR-322的靶基因CULLIN2可负调控HIF-1α的表达，发挥促血管生成作用[40]。Youn等[41]通过电穿孔将miR-322载入心脏祖细胞源性外泌体中，用于治疗AMI的小鼠，发现外泌体miR-322可显著缩小梗死面积，促进梗死边缘区域血管新生。但是，如何个体化选择需要修饰的miRNA，提高外泌体转运效率、明确外泌体miRNAs的含量与疗效之间的关系、以及降低治疗的副作用等都是我们需要考虑的问题。总之，随着研究的不断深入，体外编辑或干预外泌体miRNAs的技术有望取得重大突破，为治疗MIRI提供新方法。

外泌体作为细胞间信息交流的信使，通过转运miRNAs调节MIRI发展过程中炎症、自噬、凋亡、氧化应激等病理反应。但是，目前我们对外泌体miRNAs干预MIRI发病机制的认识有限，外泌体miRNA的提取、纯化、修饰、人工处理以及检测等技术仍有待提升，相关临床实验还需进一步完善。因此，外泌体miRNAs在MIRI的研究应用仍有待更深入的探索。