miR-204-5p、miR-1233-3p 在妊娠期高血压疾病孕妇中的表达及临床意义

吴桂梅 李冀云 金 燕 刘红玲 王文杰 邢晓红 曹艳敏

河北省沧州市中心医院产科，河北沧州 061000

妊娠期高血压疾病（hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP）是妊娠期常见合并症，发病率为5.2%～8.2%[1]，其发病机制复杂，其中胎盘功能障碍是HDCP 的主要病因，免疫因素和全身炎症反应等也参与其中[2]。微RNAs（micro RNAs，miRNAs）是一种调控基因表达的单链非编码小分子RNA，miRNAs 调控网络在多种病理过程中发挥着重要作用。现有研究显示HDCP 患者存在miRNAs 失调[3]。miR-204-5p 是已知的与恶性肿瘤相关的miRNA，在HDCP 中也出现异常表达[4]。miR-1233-3p 是一种多功能miRNA，Munaut 等[5]研究发现miR-1233-3p 在子痫前期中表达升高。本研究拟探讨miR-204-5p、miR-1233-3p 与HDCP 发病和进展的关系，并分析其对HDCP 的诊断价值。现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年12 月至2020 年6 月河北省沧州市中心医院（以下简称“我院”）收治的197 例HDCP 患者为研究对象。纳入标准：①符合2018 年国际妊娠期高血压研究学会拟定的HDCP 诊断标准[6]；②单胎妊娠。排除标准：①合并妊娠期糖尿病、肾炎、肝内胆汁淤积等其他合并症；②双胎妊娠；③合并自身免疫疾病、血液疾病、恶性肿瘤；④既往高血压、糖尿病病史。根据HDCP 分类标准将其分为妊娠期高血压组（102 例）和子痫前期组（95 例）。另随机选择同期于我院产科门诊规律围产期保健并入院待产的82 名正常足月单胎妊娠孕妇为对照组，排除妊娠期糖尿病、高血压、羊水异常、胎儿发育异常等。所有受试者均知情同意并签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 miR-204-5p、miR-1233-3p 以及炎症因子检测

所有受试者入院后72 h 内采集外周静脉血6 ml，注入两份干燥试管，一份用于检测miR-204-5p、miR-1233-3p，另一份用于检测白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）。取血清样本，Trizol 法提取总RNA，选择A260/A280为1.8～2.0 的RNA 样品，M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）按照说明将其转录为cDNA。CFX96 实时荧光PCR 仪（美国Bio-Rad）检测miR-204-5p、miR-1233-3p表达。引物序列，miR-204-5p 正 向：5’-GCCAGATCTGGAAGAAGATGGTGGTTAGT-3’，反向：5’-GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA-3’；miR-1233-3p 正向：5’-ACCTCCAGCTGGCATTATTACTTTTGG-3’，反向：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。U6 snRNA 正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR 反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5 μl，dNTP 1.6 μl，Taq DNA 聚合酶1 μl，正反向引物10 μmol/L 各1 μl，加反应缓冲液至25 μl。反应条件：95℃变性10 s，65℃退火20 s，75℃延伸15 s，共40 个循环。以U6 snRNA 为内参，2-ΔΔCt计算miR-204-5p、miR-1233-3p在各组的相对表达量。采用酶联免疫吸附试验法检测血清IL-6、TNF-α 水平，试剂盒购于北京奥维亚生物技术有限公司（批号：181025、180924）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson 相关系数，诊断效能分析采用ROC 曲线。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较

三组年龄比较，差异无统计学意义（P >0.05）。子痫前期组、妊娠期高血压组分娩孕龄、新生儿体重小于对照组，收缩压、舒张压高于对照组（P <0.05）。子痫前期组24 h 尿蛋白定量高于对照组、妊娠期高血压组（P <0.05）。子痫前期组分娩孕龄、新生儿体重小于妊娠期高血压组（P <0.05），收缩压、舒张压高于妊娠期高血压组（P <0.05）。见表1。

表1 三组一般资料比较（）

表1 三组一般资料比较（）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与妊娠期高血压组比较，bP ＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 三组血清miR-204-5p、miR-1233-3p表达及IL-6、TNF-α 水平比较

子痫前期组、妊娠期高血压组血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表达及IL-6、TNF-α 水平高于对照组（P<0.05）；子痫前期组血清miR-204-5p、miR-1233-3p表达及IL-6、TNF-α 水平高于妊娠期高血压组（P <0.05）。见表2。

表2 三组血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表达及IL-6、TNF-α 水平比较（）

表2 三组血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表达及IL-6、TNF-α 水平比较（）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与妊娠期高血压组比较，bP ＜0.05。IL-6：白细胞介素-6；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

2.3 miR-204-5p、miR-1233-3p 表达与临床参数及IL-6、TNF-α 的相关性分析

HDCP 患者miR-204-5p、miR-1233-3p 表达与分娩孕龄、新生儿体重呈负相关（rmiR-204-5p=-0.403、-0.395，rmiR-1233-3p=-0.321、-0.354，P ＜0.05）；与收缩压、舒张压、24 h 尿蛋白定量、IL-6、TNF-α 呈正相关（rmiR-204-5p=0.653、0.619、0.597、0.594、0.601，rmiR-1233-3p=0.624、0.609、0.543、0.615、0.631，P ＜0.05）；与年龄无关（rmiR-204-5p=0.165，rmiR-1233-3p=0.128，P ＞0.05）。

2.4 miR-204-5p、miR-1233-3p 诊断HDCP 的效能分析

miR-204-5p、miR-1233-3p 诊断HDCP 的最佳截断值分别为1.65、1.52，曲线下面积（area under the curve，AUC）值分别为0.607、0.621；miR-204-5p、miR-1233-3p 联合诊断HDCP 的AUC 值为0.881，大于miR-204-5p、miR-1233-3p 单独检测的AUC 值（Z=3.056、2.613，P ＜0.05）。见图1、表3。

表3 miR-204-5p、miR-1233-3p 诊断HDCP 的效能分析

图1 miR-204-5p、miR-1233-3p 诊断HDCP 的ROC 曲线

3 讨论

HDCP 以全身小血管痉挛，胎盘供血减少，滋养细胞侵袭不足为主要病理生理特征，可导致胎儿宫内发育迟缓、早产或死亡，母体脏器功能衰竭、休克甚至死亡[7-8]。目前HDCP 诊断多依靠临床表现、体征、血压/尿蛋白监测等，当发现蛋白尿时已经处于子痫前期，寻找可靠、有效的生物标志物已成为围产医学研究的热点。miRNA 具有翻译、调控基因表达功能，调控细胞增殖、分化和凋亡[9-10]，对于维持胎盘稳态和功能有重要意义[11-12]，有望成为HDCP 诊断的标志物。

miR-204-5p 为一种抑癌基因，在恶性肿瘤发生发展中的作用已被多数研究证实[13]，miR-204-5p 表达可抑制胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭[14]。miR-204-5p还可调节细胞周期蛋白D1 和细胞周期蛋白A1 表达，抑制肝癌细胞增殖和克隆生成能力[15]。Rodosthenous等[16]发现妊娠中期母体血液中循环的miR-204-5p 表达与胎儿生长发育有关。动物研究显示miR-204-5p通过靶向氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1和沉默信息调节因子2 相关酶1 mRNA3’ 非翻译区，抑制其表达，损害胎儿线粒体功能，影响胎儿发育[17]。可见miR-204-5p 可能调控妊娠期间某些生理和病理过程。本研究结果显示，miR-204-5p 在HDCP 表达升高。miR-204-5p 参与HDCP 发病机制可能为：①miR-204-5p 可能通过促使人绒毛膜细胞凋亡，导致滋养细胞侵袭不足，诱发HDCP。体外研究显示，抑制miR-204-5p 表达可促进人绒毛膜细胞增殖，减少细胞凋亡[4]。②miR-204-5p 通过下调基质金属蛋白酶9表达，降低滋养细胞增殖和侵袭能力[18]，导致HDCP。③炎症反应与HDCP 发病密切相关，miR-204-5p 过表达可通过抑制组蛋白去乙酰化酶1 表达促使炎症细胞因子产生，增加细胞凋亡[19]。本研究结果显示，miR-204-5p 与IL-6、TNF-α 水平呈正相关，提示miR-204-5p 可能通过炎症反应参与HDCP 发病。

miR-1233-3p 是一种多功能miRNA，参与细胞内周期调控，在DNA 复制增殖中起关键作用[20-21]。现有报道显示，miR-1233-3p 表达受环状RNA 调控参与多种恶性肿瘤的发生和进展，miR-1233-3p 是EHMT1 靶点，EHMT1/miR-1233-3p 通过调控基质金属蛋白酶2 表达参与乳腺癌细胞迁移和侵袭[22]。miR-1233-3p 在环状分子0007766 调控下通过靶向生长分化因子15 调控胃癌进展[23]。miR-1233-3p 在HDCP的报道并不多见，本研究结果显示，miR-1233-3p 在HDCP 中表达升高。miR-1233-3p 参与HDCP 发病的可能机制如下：①miR-1233-3p 可介导细胞定向转移，激活趋化因子受体表达，促使炎症细胞产生转移[24]，损伤血管内皮组织，导致胶原组织暴露，组织因子释放，刺激血小板黏附聚集，激活凝血反应、高凝状态和纤溶亢进，最终发生HDCP。本研究结果显示，miR-1233-3p 表达与IL-6、TNF-α 水平呈正相关，说明miR-1233-3p 可能通过炎症反应参与HDCP 发病。②cAMPPKA 信号通路可调节胎盘滋养细胞分化，miR-1233-3p 通过抑制cAMP-PKA 信号通路相关蛋白表达，参与HDCP 的发生和发展[25]。③miR-1233-3p 可靶向抑制HoxB3 表达，引起Na+峰和后除极改变，导致Ca+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ及依赖性兰尼碱受体磷酸化，引起钙钠交换异常，影响血管平滑肌张力，导致高血压[24]。

ROC 曲线结果显示，miR-204-5p、miR-1233-3p对HDCP 诊断均具有一定价值，联合检测明显提高了HDCP 的诊断效能。如果miR-204-5p、miR-1233-3p表达同时升高，妊娠期间罹患HDCP 的风险更大，临床应给予重视和干预。

综上所述，HDCP 患者血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表达上调，miR-204-5p、miR-1233-3p 表达与分娩孕龄、新生儿体重均有关。miR-204-5p、miR-1233-3p 可能通过上调炎症反应参与HDCP 发病过程，联合miR-204-5p、miR-1233-3p 对HDCP 诊断具有较高应用价值。