基于数据挖掘和网络药理学探究抽动障碍专利复方的用药规律与作用机制

王笑冉 郑 攀 孙世杰

1.河南中医药大学基础医学院，河南郑州 450046；2.河南中医药大学方剂学科，河南郑州 450046

抽动障碍（tic disorder，TD）是儿童最常见的神经发育障碍之一，其表现为面部、四肢、躯干部肌肉不自主抽动，伴喉发异声或秽语，常共患情绪或行为障碍，严重危害儿童身心健康[1]。近年来，TD 患病率逐年增加，全球学龄儿童TD 发病率为12%～16%，仅中国就有1000 多万例患儿，短暂性和轻度抽动影响约20%学龄儿童[2-3]。

中医学将本病归于“肝风”“慢惊风”等范畴[4]，认为其病机特点为本虚标实，病位主要在肝，由五志过极，风痰内蕴而引发。如《小儿药证直诀》载“凡病或新或旧，皆引肝风，风动而止于头目，上下左右如风吹，不轻不重，儿不能任，故目连扎也”。明·王肯堂《证治准绳·幼科》曰“水生肝木，木为风化，木克脾土，胃为脾之腑，故胃中有风，瘛疭症状，两肩微耸，两手下垂，时腹动摇不已”。TD 发病机制复杂，涉及遗传、神经、免疫、环境等因素[5]。近年来，多项研究显示中医药通过辨证论治，可全方位、多靶点控制抽动症状，彰显出独特优势[6-7]。现通过数据挖掘分析抽动障碍专利复方的用药规律，并结合网络药理学阐释其核心药物作用机制，以期为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

以“抽动障碍”“中医药”为主题词检索中国知网和国家知识产权局专利数据库（http://pss-system.gov.cn），时限为建库至2020 年12 月31 日。纳入标准：已公开的治疗抽动障碍的中药专利复方，剂型不限。排除标准：联合用药、单味中药或未标明具体药物的专利；剔除随证加减药物、周期用药复方、外用复方。参照2015 版《中华人民共和国药典》[8]对处方药物名称、类别进行规范化处理。

1.2 分析方法

利用SPSS 21.0、SPSS Modeler 18.0 软件统计药物类别、频数并进行关联分析，对频数排名前20 的药物进行复杂网络分析和系统聚类分析。通过中药系统药理学数据库与分析平台、DrugBank 数据库筛选频数排名前5 的核心药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18[9]的活性成分及相关靶点，DrugBank、GeneCards、OMIM 数据库获取疾病相关靶点。将药物和疾病靶点通过Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库[10]进行标准化处理并取交集，得到核心药物治疗抽动障碍的有效靶点，并导入STRING 数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络；通过Cystoscape 3.7.0 软件行拓扑学网络分析以评估有效靶点在全网络中的重要程度，借助Metascape 数据库对关键靶点行GO 分析和KEGG 信号通路分析。

2 结果

2.1 频数统计

共检索出专利复方93 个，涉及中药243 味，总频次1021 次；其中频次≥15 的药物共20 味，累计频次561 次，占总用药频次的54.9%。频数排名前5 的核心药物为天麻、白芍、茯苓、钩藤、石菖蒲。由于专利复方中有较多使用如刺沙蓬、寸金草等133 味特色药，使用频次133 次，占总频次13.02%，其中大多未被中药学收录，不便于归纳，所以仅纳入频次≥2 的中药进行类别统计。见图1。

图1 药物频数、类别统计雷达图

2.2 关联规则分析

通过Apriori 建模挖掘药物的配伍关系。支持度指A 与B 同时出现的概率，置信度指当A 出现时B 出现的概率，提升度指关联规则中A 与B 的相关性，提升度>1 且越高表明正相关性越高。设置支持度>10%，置信度>85%，提升度>1，挖掘出16 个药物配伍。见表2。

2.3 复杂网络分析

利用SPSS Modeler 18.0 软件对高频药物进行复杂网络分析。线条粗细表示药物链接的强弱程度，强链接药物组合包括天麻与白芍、钩藤、茯苓、石菖蒲、甘草，白芍与甘草、钩藤与茯苓、白芍与茯苓共8 个。见图2。

图2 高频药物复杂网络分析

2.4 系统聚类分析

利用SPSS Statistics 21.0 软件对高频药物进行系统聚类分析，聚类方法采用Ward 法，取类间距离为20，得到5 组药物聚类组合分别为C1：半夏、陈皮、茯苓、石菖蒲、远志、白术；C2：龙骨、牡蛎、胆南星、地龙；C3：天麻、僵蚕、白芍；C4：钩藤、白蒺藜、全蝎；C5：羚羊角、地黄、防风、甘草。见图3。

图3 高频药物系统聚类分析图

表1 药物关联规则分析

2.5 核心药物活性成分及靶点收集

共筛选出核心药物活性成分79 个，相关靶点372 个。通过Cytoscape 3.7.0 软件构建“药物-活性成分-靶点网络”，对药物活性成分及靶点（node）进行形状颜色标注，两者间的相互关系则用边（edge）表示。共137 个节点，1263 条边。见图4。

图4 药物-活性成分-靶点网络

2.6 疾病靶点收集

共得到抽动障碍相关靶点1259 个，与药物交集靶点137 个，借助Omicshare 进行Venn 图可视化处理。见图5。

图5 药物-疾病交集靶点Venn 图

2.7 PPI 网络构建和关键靶点筛选

将137 个有效靶点导入STRING 数据库构建PPI网络，借助“Network Analyzer”插件进行拓扑分析，选取自由度（Degree ）、介数（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于均值（Degree 均值为28，Betwee ness 均值为0.0074，Closeness 均值为0.5122）的靶点共34 个为关键靶点，并依据度值进行形状大小标注，其中度值排名前10 的靶点为核心靶点，包括INS、AKT1、FOS、IL6、CXCL8、VEGFA、TP53、NGF、TNF、EGF。见图6。

图6 PPI 网络构建及关键靶点筛选

2.8 GO 分析和KEGG 通路分析

通过Metascape 对34 个关键靶点进行GO 分析和KEGG 通路分析，以P <0.01，最小计数为3 和富集因子>1.5 为限制条件。GO 结果包括3 类：生物过程（biological progress，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular functions，MF）。其中BP 相关条目20 个，包括化学突触传递、神经递质水平调节等；CC 相关条目6 个，表现在突触前膜、膜面等；MF 相关条目11 个，其有受体配体活性、G 蛋白偶联受体结合等。见图7。

图7 关键靶点GO 富集分析

KEGG 分析得到12 条信号通路，包括神经活性配体-受体相互作用、cAMP 信号通路等，并计算各信号通路富集因子，绘制气泡图。见图8（封三）。

3 讨论

3.1 用药规律

药物类别主要为平肝熄风药和补虚药，二者使用频次占总频次的51.01%，其次为清热药、安神药、解表药、化痰药等。小儿肝常有余脾常虚，若禀赋素弱，或思虑紧张，致脾虚气弱，失于运化，痰浊内生，阻于心窍，致脾气乖戾，喉发异声；或郁久化热，上扰心神，则抽动呼叫，秽语时出；或见风痰鼓动，流窜经络，则四肢抽动。《临证指南医案》载“肝为风脏，因精血衰耗，水不涵木，木少滋荣，故肝阳偏亢，内风时起而现风症”。因此临床多表现为肝脾肾亏虚，风火痰瘀胶结成积。用解表药之意在于宣肺、疏肝和发散外邪：宣肺之法，可使清气升，浊气降，利于肝气疏泄；肝木不达则气滞，借助疏肝以条达气机；《西医书屋夜话录》载“凡人必先有内风而后外风，亦有外风引动内风者”，用解表药以熄外风而平内风，令风静动止。聚类和关联分析显示：半夏、陈皮、茯苓合用，有《太平惠民和剂局方》中二陈汤之意，可燥湿化痰，理气和中。龙骨、牡蛎皆可平肝熄风，重镇安神。《本草求真》曰：“龙骨功与牡蛎相同，但牡蛎咸涩入肾，有软坚化痰清热之功，此属甘涩入肝，有收敛止脱镇惊安魄之妙。”钩藤味甘微寒、入心肝经，善清心包之火，泄肝经之热而熄风定惊止抽；白蒺藜苦泄辛散，疏肝平肝；全蝎味辛而甘，功专祛风。诸药合用，则肝热可清，肝风可祛。羚羊角、生地、防风、甘草为羚角钩藤汤的主要组成，具有凉肝熄风，增液舒筋的功效。天麻、钩藤、白芍、茯苓、石菖蒲、甘草是治疗抽动障碍用药的关键。其中天麻与钩藤，皆可平肝熄风；白芍伍甘草即芍药甘草汤，酸可收，甘可缓，共奏柔肝缓急之效；茯苓、石菖蒲清热化痰。与抽动障碍肝亢风动、阴虚风动、痰热动风的病机特点相一致。

3.2 作用机制

神经递质紊乱及相应信号通路受损是TD 发生的重要原因，目前已证实的有多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺及氨基酸类神经递质[11-14]。PPI 网络拓扑分析得到AKT1、FOS、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）等10 个核心靶点。其中AKT1 是磷酸肌醇被募集到质膜而激活的一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用[15]。在中枢神经，IL-6 可通过激活JAK/STAT3、PI3K/AKT 等信号通路，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体激活介导的Ca2+内流，减轻钙超载所导致的兴奋性神经毒性损伤。此外，IL-6 可活化反应性星形胶质细胞，增加粘连蛋白表达，调控神经轴突损伤再生[16-17]。在神经兴奋毒性或氧化应激条件下，VEGFA 能增加海马神经元、小脑颗粒细胞和多巴胺能神经元的存活[18]。FOS 参与多种神经元活动，其阳性神经元的数量与所受神经刺激强度成正比[19]。以靶蛋白为媒介，核心药物有效成分与相关通路存在密切联系，基于此发挥治疗作用。神经活性配体受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合[20]。其中A 类生物胺受体基因Chrm3 表达上调可增强胆碱能功能，提高学习和记忆能力[21]。TD 患儿存在多巴胺系统的过度活跃或相关受体超敏感[22]，其中多巴胺D1 类受体正性调控环磷酸腺苷水平，通过激活蛋白激酶A 而调控细胞代谢，使跨膜G 蛋白偶联受体去敏感化，导致细胞神经递质释放[23]。正常情况下，中枢神经元突触前膜上的转运体可通过调节神经递质的释放和再摄取，核心药物可通过影响单胺跨膜转运蛋白活性，调节神经递质含量和作用时间。作为中枢神经系统与外周免疫系统相互作用的信使，血清中大量细胞因子聚集会造成神经基底节损伤[24-25]，导致皮质-纹状体-丘脑-皮质环路的功能异常，引发一系列不自主的运动行为障碍[26]，核心药物可影响细胞因子通路上的11 个靶点。

综上，中医药治疗抽动障碍以平肝熄风药、补虚药为主，立足于补肝脾肾之虚，兼顾心肺。作用机制方面，核心药物可通过AKT1、IL-6、VEGFA 等核心靶点，调节化学突触传递、神经递质水平等生物过程，影响神经活性配体受体相互作用、cAMP 信号通路等治疗通路，多成分、多靶点、多通路治疗抽动障碍。本研究通过数据挖掘分析已公开的抽动障碍专利复方用药规律，并结合网络药理阐释其核心药物作用靶点及通路，结果较为可靠，将通过试验进一步的验证。