幽门螺杆菌Hp1188 蛋白的免疫保护效果

韩飞，张帅帅

重庆大学附属三峡医院医学检验科，重庆 404100

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）感染人体后难以自发清除，常引起消化系统疾病，甚至胃癌［1］。目前临床上采用“三联”或“四联”疗法治疗H. pylori 感染，由于患者服药不规律及H. pylori 对抗生素耐药，根除率持续下降，导致治疗失败。因此，发展疫苗来防治H. pylori 感染意义重大［2-3］。

Hp1188 蛋白是大量表达于H. pylori 表面的高度保守的黏附素蛋白［4］，具有黏膜结合能力，符合疫苗保护性抗原要求。目前临床上诊断H. pylori 感染的方法有两种：一种是尿素呼气试验（urea breath test，UBT）为代表的非侵入性方法，但有价格昂贵和放射性污染的弊端；另一种是通过内镜方式侵入性检查法，如快速尿素酶试验（rapid urease test，RUT），为有创检查，具有部分患者不适用、不适合复查的缺点。因此，有必要寻找准确、价廉、安全、患者易接受的血清学诊断方法。本研究将重组Hp1188 蛋白提纯鉴定后，作为抗原包被酶标板，ELISA 法检测100份临床血清样本，为Hp1188 蛋白作为诊断试剂应用于临床提供依据；将重组Hp1188 蛋白口服灌胃免疫小鼠，研究其保护效果，为进一步探讨H. pylori感染的黏附机制，制备预防H. pylori 感染的疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 菌株 重组菌pQE30-hp1188-DH5α 和H. pylori悉尼株1（Sydney strain 1，SS1）由重庆大学附属三峡医院医学检验科保存。

1. 2 主要试剂及仪器 重组HpaA 蛋白由重庆大学附属三峡医院医学检验科保存；H. pylori 阳性病人血清来自重庆大学附属三峡医院消化内科现症感染者；HRP 标记的羊抗人IgG 为北京中山生物技术有限公司产品；生物素标记的羊抗鼠单克隆抗体IgA、IgG 购自武汉华美生物工程有限公司；蛋白质marker为立陶宛Fermentas 公司产品；Western blot 试剂盒为博士德生物工程有限公司产品；Ni2+-NTA 层析柱、琼脂糖、IPTG、SDS、DTT、EDTA、考马斯亮蓝R250 和霍乱毒素B 亚单位（cholera toxin subunit B，CTB）均为美国Sigma 公司产品。

1. 3 实验动物 清洁级BALB ／ c 小鼠40 只，雌性，6 周龄，体重18 ～20 g，购自重庆医科大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK 渝2012。

1. 4 重组Hp1188 蛋白的制备及鉴定 参照文献［5］方法制备重组Hp1188 蛋白：冰浴下超声裂解诱导表达的菌液，上清液中加入2 mL 50%的Ni2+-NTA 树脂溶液，0 ℃冰浴1 h；用洗脱液（50 mmol ／ L NaH2PO4，300 mmol ／ L NaCl，250 mmol ／ L 咪唑）洗柱，收集洗脱液，取样进行12% SDS-PAGE 分析。收集目的蛋白管，聚乙二醇8000 浓缩，获得重组Hp1188 蛋白，采用Bradford 法定量，并进行Western blot 分析：纯化的重组Hp1188 蛋白经12% SDS-PAGE 分离后，半干湿法电转移至NC 膜上，加入封闭液，室温封闭2 h；PBS 洗膜后，加入H. pylori 感染者血清，室温作用2 h；PBS 洗膜，再加入HRP 标记的羊抗人IgG（1 ∶1 000 稀释），室温220 r ／ min 转摇2 h；PBS振洗后，DAB 显色10 ～15 min；双蒸水冲洗，终止染色。

1. 5 Hp1188 抗体间接ELISA 方法的建立及其敏感性、特异性分析 以制备的重组Hp1188 蛋白为包被抗原建立间接ELISA 法，检测血清Hp1188 抗体。分别以0. 15、0. 3、0. 5、0. 6、1. 2、2. 4、5 μg ／ mL 的重组Hp1188 蛋白包被聚乙烯微孔板，100 μL ／ 孔，4 ℃湿盒过夜；加入1 ∶5、1 ∶10、1 ∶40、1 ∶80、1 ∶160稀释的H. pylori 阳性现症感染病人血清进行方阵滴定，设空白对照和阴性对照（H. pylori 阴性血清标本）；同法测定HRP 标记羊抗人IgG 抗体的最佳工作浓度（设1 ∶1 000、1 ∶2 000 两个浓度）。间接ELISA法界值的确定：检测20 份H. pylori 阴性血清标本，以阴性标本A450值的均数加3 个标准差为正常的上限；高于上限的为Hp1188 抗体阳性。用包被好的96 孔板按照上述步骤检测血清Hp1188 抗体，以A450值≥0. 5 判为Hp1188 抗体阳性。临床筛选H. pylori 现症感染者标准为UBT 和RUT 中任一项阳性即被认为存在H. pylori 感染，二者均阴性者为无H. pylori 感染。收集近期经临床确诊的消化内科住院现症感染者H. pylori 阳性血清40 份，体检正常阴性血清30 份，均用上述包被好的96 孔板检测，分析其敏感性和特异性，计算符合率。选择近期同时进行UBT 和RUT 检测病例100 例，男女各50 例，年龄为20 ～60 岁，所有病例均无胃手术史，近4 周内均未服用抗H. pylori 药物，同时采集血清，用包被好的96 孔板采用间接ELISA 法检测Hp-1188 抗体。

1. 6 重组Hp1188 蛋白的免疫保护效果检测 将40只BALB／c 小鼠随机分为A、B、C、D 4 组，每组10 只。A 组（阴性对照）每只免疫布氏肉汤（北京陆桥公司）500 μL，B 组（PBS 对照）每只免疫PBS 500 μL，C组每只免疫Hp1188 100 μg + CTB 10 μg，D 组每只免疫HpaA 100 μg + CTB 10 μg。均用饲喂针经口灌胃免疫方式，每周1 次，共4 次。末次免疫后第7、9、11 天，除A 组外，均用新鲜培养的2×108CFU／mL H. pylori SS1 菌液0. 5 mL 经口灌胃攻击，1 次／ d，连续感染3 次。末次感染后4 周，乙醚麻醉后采集小鼠血清，ELISA 法检测特异性IgG、IgA；收集肠黏液上清，检测特异性sIgA；无菌纵切胃组织3 份，分别进行H. pylori 定植量检测、RUT 及病理学检查（HE 染色和改良Giemsa 染色）。

1. 6. 1 血清IgG、IgA 和小肠黏液sIgA 检测 将纯化的重组Hp1188 蛋白按50 μg ／ mL 包被ELISA板，2%明胶室温封闭1 h 后，加入小鼠血清（1 ∶100稀释）或小肠黏液原液100 μL，37 ℃孵育60 min；PBS 洗涤4 次，分别加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1 ∶20 000 稀释）、IgA（1 ∶1 000 稀释），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育30 min；PBS 洗涤4 次，加入邻苯二胺，37 ℃避光反应15 min；加入2 mol ／ L H2SO4，50 μL ／ 孔，终止反应。以PBS 孔作为空白对照，酶标仪波长450 nm处测定各孔A 值。

1. 6. 2 胃黏膜H. pylori 定植及炎症评分 无菌操作将小鼠胃组织放入无菌研磨器内，加入1 000 μL布氏肉汤研磨成混悬液，充分匀浆后将组织液分别进行1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000 稀释，分别取100 μL接种至7%羊血琼脂平板上，用无菌L 型涂抹棒均匀涂布，37 ℃微需氧培养3 ～4 d 后，挑取可疑菌落，按常规方法鉴定并计数。RUT 根据颜色深浅程度评分：黄色为阴性，记为0 分；紫红色为强阳性，记为4分。胃黏膜H. pylori 病理学检查：Giemsa 染色后，观察10 个视野胃小凹中H. pylori 的定植，并进行半定量评分：0 分为无H. pylori 定植，1 分为部分胃小凹有1 ～2 条H. pylori，2 分为多数胃小凹有3 ～10 条H. pylori，3 分为多数胃小凹有超过10 条H. pylori；HE 染色后，参照新悉尼系统的直观模拟评分［6］判断炎症程度，将正常、轻度、中度、重度4 个等级分别评为0、1、2、3 分。

采用H.pylori 定植计数、RUT、病理学检查评分来综合判断小鼠胃组织内H.pylori 感染状况。H.pylori感染阳性判定标准［7］：有两种及以上阳性判为阳性感染，计算保护率。

1. 7 统计学分析 计数资料采用SPSS 11. 0 软件进行χ2检验，计量资料以±s 表示，各组之间利用SPSS 11. 0 软件进行t 检验，以P ＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 重组Hp1188 蛋白的鉴定 纯化的重组Hp1188蛋白经12% SDS-PAGE 分析，纯度可达90%。Bradford 法测定Hp1188 蛋白含量为1. 0 mg ／ mL。Western blot 分析在相对分子质量30 600 处出现相应条带，大小与预期一致，见图1。

图1 重组Hp1188 蛋白的Western blot 鉴定Fig. 1 Western blotting of recombinant Hp1188 protein

2. 2 Hp1188 抗体间接ELISA 检测方法的敏感性和特异性 最终确定Hp1188 抗体间接ELISA 检测方法的重组Hp1188 蛋白最适包被浓度为5 μg ／ mL，最适血清稀释度为1 ∶10，酶标二抗稀释度为1 ∶1 000。用自制的重组Hp1188 蛋白检测H. pylori 现症感染者和体检正常者血清的敏感性及特异性良好，分别为100%和90. 0%，符合率为95. 7%（χ2= 1. 759 5，P = 0. 605 8），见表1。100 例入选者中H. pylori 感染65 例，未感染35 例。通过对临床病例的检测结果显示，Hp1188 抗体试剂检测的敏感性为93. 8%，特异性为94. 3%，见表2。

表1 间接ELISA 法检测Hp1188 抗体的敏感性及特异性Tab. 1 Indirect ELISA of sensitivity and specificity of Hp1188 antibody

表2 3 种H. pylori 检测方法敏感性及特异性的比较Tab. 2 Comparison of sensitivity and specificity of three methods for detection of H. pylori

2. 3 重组Hp1188 蛋白的免疫保护效果

2. 3. 1 小鼠血清及小肠黏液特异性抗体水平ELISA 结果显示，C 组与B 组相比，小鼠血清、小肠黏液均产生了针对Hp1188 蛋白特异的IgG、IgA 和sIgA 反应，且差异均有统计学意义（t 分别为6. 010 1、7. 049 5 和4. 261 6，P 分别为0. 000 2、0. 000 1和0. 002 1）。特别是在小肠黏液，sIgA 水平的显著升高可能参与了H. pylori 的保护免疫作用。C 组与D 组之间差异均无统计学意义（t 分别为0. 055 4、0. 354 4 和0. 037 9，P 分别为0. 957 0、0. 731 2 和0. 970 5）。见表3。

表3 各组小鼠免疫后血清和小肠黏液特异性抗体水平（A405，± s，n = 10）Tab. 3 Specific antibody levels in serum and intestinal fluid of mice in various groups（A405，±s，n = 10）

表3 各组小鼠免疫后血清和小肠黏液特异性抗体水平（A405，± s，n = 10）Tab. 3 Specific antibody levels in serum and intestinal fluid of mice in various groups（A405，±s，n = 10）

注：与B 组比较，aa 表示P ＜0. 01；aaa 表示P ＜0. 001。

血清IgAIgG A0. 061 ± 0. 0120. 092 ± 0. 0180. 212 ± 0. 045 B0. 248 ± 0. 0570. 325 ± 0. 0610. 859 ± 0. 198 C1. 497 ± 0. 147aaa1. 795 ± 0. 126aaa2. 523 ± 0. 356aa D1. 504 ± 0. 1521. 811 ± 0. 1382. 511 ± 0. 391组别小肠黏液sIgA

2. 3. 2 活菌攻击后H. pylori 感染情况 试验结果显示，C 组H. pylori 活菌定植量、RUT 及病理学检查（Giemsa 染色和HE 染色）指标均明显低于B 组，且差异均有统计学意义（t 分别为2. 956 7、4. 389 9、4. 076 9 和3. 477 5，P 分别为0. 016 0、0. 001 7、0. 002 8 和0. 006 9），C 组免疫保护率为70%，高于B 组；而C 组与D 组之间各指标差异均无统计学意义（t 分别为0. 147 5、0. 145 2、0. 110 7 和0. 061 2，P 分别为0. 885 9、0. 887 7、0. 914 3 和0. 952 5）。见表4。病理学检查显示，C、D 两组小鼠胃组织慢性炎症浸润程度较轻，见图2，表明C 和D 组小鼠获得免疫保护。

表4 各组小鼠胃黏膜H. pylori 感染情况（±s，n = 10）Tab. 4 H. pylori infection in gastric mucosa of mice in various groups（±s，n = 10）

表4 各组小鼠胃黏膜H. pylori 感染情况（±s，n = 10）Tab. 4 H. pylori infection in gastric mucosa of mice in various groups（±s，n = 10）

注：与B 组比较，a 表示P ＜0. 05；aa 表示P ＜0. 01。

组别H. pylori 定植量（× 104 CFU）RUT（评分）Giemsa 染色（评分）HE 染色（评分）感染只数保护率（%）A 0 0 0 0 0／B 1. 57 ± 0. 163. 80 ± 0. 422. 50 ± 0. 522. 80 ± 0. 42100 C 1. 03 ± 0. 17a0. 76 ± 0. 57aa0. 31 ± 0. 25aa0. 69 ± 0. 58aa370 D 1. 01 ± 0. 150. 69 ± 0. 570. 33 ± 0. 170. 66 ± 0. 58280

图2 各组小鼠胃黏膜H. pylori 定植（Giemsa 染色）和炎症反应（HE 染色）观察Fig. 2 H. pylori colonization（Giemsa staining）and infla-mmation（HE staining）in gastric mucosa of mice in various groups

3 讨 论

目前临床上主要应用抗生素治疗H. pylori 感染，存在因细菌耐药造成治疗失败等问题。在改进治疗方案的同时，疫苗可作为根治H. pylori 的研究方向［8-11］。分析H. pylori 感染过程发现，H. pylori 借助菌体表面的黏附素蛋白可成功定植于胃黏膜，这是致病的关键环节。因此，建立阻止或消除H. pylori黏附定居的免疫保护机制是H. pylori 疫苗研究的方向。黏附素Hp1188 蛋白大量表达于H. pylori 表面，有黏附能力，免疫原性强，可作为保护性抗原构建疫苗。通过口服H. pylori 疫苗增强黏膜免疫力，可抑制H. pylori 黏附定植在胃部，在初期感染时即能通过阻断吸附将H. pylori 清除出人体，从源头上避免感染，达到预防疾病的目的。

目前国内外文献报道的H. pylori 黏附素较多［12-13］，其中黏附素A（H. pylori adhesion A，HpaA）已证实是主要的保护性抗原［14］。较多学者利用HpaA进行针对H. pylori 感染的免疫防治研究，取得了良好的效果［15-16］。本研究用纯化的重组Hp1188 蛋白包被酶标板，ELISA 法检测确诊病例和临床血清样本，与目前常用诊断方法的符合率为95. 7%，检测敏感性为93. 8%，特异性为94. 3%，提示Hp1188蛋白可作为有效的H. pylori 抗原，以非侵袭性血清学方式检测，可用于初筛或流行病学调查。本研究还以黏附素HpaA 作为比较标准，用纯化的重组Hp1188 蛋白免疫小鼠，结果表明，Hp1188 蛋白具有天然蛋白的抗原性和免疫反应性，亦有望作为保护性抗原之一。采用纯化的重组Hp1188 蛋白联合黏膜免疫佐剂CTB 灌胃免疫小鼠，H. pylori 攻击后评价预防效果，同时与HpaA 蛋白免疫进行比较，结果发现，重组Hp1188 蛋白与HpaA 蛋白作为保护性抗原的保护率相当，提示Hp1188 和HpaA 蛋白均可有效抑制H. pylori 在小鼠消化道内的定植和生长；两者与对照组相比，差异均有统计学意义（P ＜0. 05）。Hp1188 蛋白能减弱H. pylori 的黏附作用，为开发免疫原性好又可减少黏附的H. pylori 疫苗奠定了实验基础。

本研究建立的ELISA 血清学方法检测例数不足，还应增加抗干扰能力分析，并与H. pylori 免疫印迹法检测进行比较。设计的口服疫苗免疫方案样本量较小，为使结果评价更客观，除了增加样本量外，还应对疫苗抗原口服刺激小鼠产生的免疫应答类型，以及口服后保护性抗原在胃内活性的保持等方面进行深入研究。