PACT的抗菌作用及其机制的研究进展

乔宏伟，房 岩(综述)，方子源，赵占娟(审校)

(1.河北大学临床医学院临床医学专业，河北 保定 071002；2.河北大学基础医学院医用物理学教研室，河北 保定 071002)

世界卫生组织统计表明，2017年全球由医院获得性感染(hospital acquired infection,HAI)造成的死亡人数约100万人，每100例住院患者中，就有7例发达国家患者和10例发展中国家患者获得HAI。耐药菌是HAI中常见的感染菌，一些耐药突变菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和艰难梭菌变异迅速，通过医院设施和个人护理用品快速传播，感染形势严峻，对人类生命健康产生威胁。因此，开发不易产生耐药性的新型抗菌方法和抗菌药物已成为一个重要研究方向。光动力抗菌化学疗法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)作为最具前景的一种新型抗菌方法，具有高选择性、广谱抗菌性、不良反应低以及对病原微生物不易引起耐药等优点。现将重点讨论PACT的抗菌机制及新型光敏剂的研究进展。

1 PACT概述

20世纪初，Raab发现在阳光和光敏染料吖啶红的作用下，微生物草履虫会被杀死，并推测该现象是阳光将能量传递给化学物质的作用结果，随后Tappeiner发现光诱发强烈的敏化反应时必须有分子氧的存在，并把有分子氧参与的这种光敏化反应称为光动力作用(photodynamic therapy,PDT)。随着研究的深入，人们发现PDT的作用效果与光敏剂的理化性质密切相关，如果设计出一种能够只与微生物细胞选择性结合的新型光敏剂，光动力就可以实现抗菌作用，即PACT作用。Jodlbauer和Huber分别在1904年和1905年成功描述光动力灭活细菌。但早期PDT多用于治疗癌症，即全身静脉注射或局部使用光敏剂，避光一段时间后，再行激光照射杀灭肿瘤细胞。用于治疗细菌性疾病的抗生素是在20世纪中叶发现的，但在1940年发现青霉素不久，便出现许多治疗失败的案例并分离出一些对青霉素不再敏感的细菌菌株，这标志着抗生素耐药性时代的开始。如果不采取任何措施阻止多重耐药细菌的增长，预计到2050年将有3亿人过早死亡，将使世界经济损失100万亿美元[1]。

PACT对耐药微生物有很好的杀灭作用，迄今为止，尚未有明显的证据表明PACT会在微生物中产生耐药性，Giuliani等[2]发现即使经过20次连续的局部杀伤，PACT仍能发挥很好的作用。PACT的另一个优点是光敏剂可局部应用于感染区域。许多慢性感染具有生物膜状态细菌的聚积现象，抗生素不易渗透到生物膜中，而PACT却能杀死生物膜状态的细胞。因此，PACT作为一种无耐药性、毒副作用小、作用效果显著的潜在临床抗微生物疗法得到国际社会的广泛关注。

2 光敏剂的研究进展

由于PACT的作用效果与光敏剂(photosensitizer，PS)的理化性质密切相关，因此开发光毒性低、代谢时间短、活性氧物种(reactiveoxygenspecies,ROS)量子产率高、具有明显阳离子电荷的PS成为学者的研究热点之一。纳米尺度的光敏剂与普通光敏剂相比，不但水溶性好，而且还可以产生更多的ROS，进而具有良好的灭菌效果。现总结近几年有关新型光敏剂研究的最新进展。

2.1富勒烯及其衍生物 富勒烯是一种封闭的足球状碳同素异形体，富勒烯具有高度共轭的双键，对可见光有很好的吸收，具有较高的三重态量子产率，但它们的聚集倾向和高度疏水性，使得其作为药物在生物医学中的应用前景不大，所以改善富勒烯的水溶性研究很有意义。目前为克服富勒烯的这些缺点，已经有许多用于富勒烯增溶和药物递送的方法，包括树状聚合物，胶束，PEG化等。Tegos等[3]设计三种聚阳离子富勒烯衍生物和三种聚阴离子富勒烯衍生物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行灭活，其中三种聚阳离子富勒烯衍生物显示出极强的PACT作用，无论施加何种光，金黄色葡萄球菌的杀灭率均高达99.999 9%。体外实验及体内局部感染动物实验证明聚阳离子富勒烯衍生物具有高效抗菌特性。Yu等[4]将富勒烯衍生物的聚阳离子与荧光素以共价键联合，由于改变了其分子结构，增加了溶水性的氨基，从而提高了在水中的溶解度，并且证明了静电荷对水溶液中富勒烯-荧光素结构的构象及其光物理性质和光化学活性的重大影响。聚阳离子富勒烯衍生物-荧光素共轭物由于从荧光素到富勒烯的能量(电子)的转移表现出强烈的荧光猝灭效应，使其活化产生的活性氧效率是单个荧光素或未修饰富勒烯的15倍以上。改良后的富勒烯作为新型抗菌光敏剂具有很强的光稳定性，能够产生高毒性的羟基自由基等，但也具有波长相对较短，不能很好地穿透组织等缺点，若将其应用于局部感染区域则会达到良好的抗菌效果。

2.2石墨烯及其衍生物 石墨烯是一种二维材料且带隙为零，石墨烯及其衍生物的抗菌研究前景广阔。Xia等[5]研究了等离子体Ag/AgX(X=Cl,Br,I)复合材料链接石墨烯薄片在可见光照射下的细菌灭活机制，研究显示该复合材料的抗菌失活率明显提高，其抑菌性能主要是由于消毒液中H2O2等活性氧的形成和银离子的杀菌性能，石墨烯薄片通过提供必要的电荷分离来延迟复合速率。Khadgi等[6]报道了ZnFe2O4与Ag和rGO(还原氧化石墨烯)共修饰形成新型复合材料，在可见光照射下，大肠杆菌菌株在60 min内失活，失活率达7log以上，SEM图像也显示了破坏后的细菌残骸，活性氧清除实验确定失活过程的主要活性氧种类为H2O2。Rtimi等[7]也证明具有明显活性的磷酸铁聚乙烯透明薄膜额可用于细菌灭活；研究表明，在阳光照射下，透明的薄膜会变成超亲水性，从而使细菌完全矿化的时间从60 min缩短到30 min。

2.3二氧化钛及其衍生物 TiO2是一种半导体，它具有毒性小、光吸收强、成本低、化学稳定性高等优点。Ouyang等[8]制备了C70与TiO2复合材料，研究了其在可见光照射下的杀菌活性。由于羟基自由基的大量产生，使其杀灭大肠杆菌的消毒率是未修饰TiO2的2倍以上。Koli等[9]发现在可见光照射下，TiO2/MWCNT复合材料由于MWCNT的有效电荷分离，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果更强。Liu等[10]研究了在可见光照射下TiO2/Ag3PO4复合材料对禾谷镰刀菌的杀菌效果。由于制备的复合材料引入了有效的电荷分离，提高了可见光的吸收性能，在照射后100 min内，真菌被有效地灭活。Rtimi等[11]研究了铜修饰TiO2-ZrO2的光催化杀菌效果。由于带负电荷的细菌细胞壁上的磷酸根和巯基与铜(强电子供体)有很强的亲和力，抗菌性能突出，使其即使在极低的铜含量下，铜修饰复合材料的失活能力也比未修饰的TiO2-ZrO2高出3倍。

2.4铋基及其衍生物 铋基复合材料是近几年研究人员偶然发现的新化合物，具有明显的窄带隙，因此与传统的光催化剂如TiO2和ZnO相比，其可见光吸收能力更好。Wang等[12]制备了一种新型可见光活性光催化剂单斜二异硫四氧化物，研究其杀菌活性，发现在可见光照射下120 min内，细菌被完全灭活。Adn等[13]研究了不同Er3+和Y3+掺杂量的BiVO4样品对细菌的灭活效果，发现所有铋样品在紫外光和可见光照射下均表现出3log的失活。

2.5其他新型抗菌剂PS 许多实验室尝试引入具有更高活性的化合物，或者是天然存在的染料[14]。例如，阳离子锌酞菁RLP068、阳离子苯丙烯酮衍生物SAPYR和卟啉Sylsens B具有较高抗菌活性；从天然产物中衍生出的高效化合物，例如：从圣约翰麦汁(St John's Wort)中衍生出的阳离子金丝桃素化合物、从维生素B2衍生出的阳离子核黄素化合物以及姜黄素(姜黄中发现的黄色香料)的阳离子衍生物SACUR-3等均具有很好的抗菌效果。

3 无机盐增强PACT作用的研究进展

Kasimova等[15]发现在噻嗪染料中添加叠氮化钠可增强革兰阳性和阴性细菌的PACT作用，他认为这归因于电子从叠氮化物阴离子转移到PS三重态，产生叠氮基自由基，进而PACT作用得到增强。Yin等[16]发现添加叠氮化物阴离子，富勒烯衍生物介导的PACT作用同样得到加强。叠氮离子的增强表现为通过电子转移机制产生成叠氮基自由基。需要注意的是，理论上叠氮化物增强微生物的光杀灭作用可行，但其毒性却阻碍了临床应用。

Vecchio等[17]通过在体外和体内添加碘化钾，亚甲基蓝介导的PACT作用持续增强。在体内还观察到在治疗后的几天中伤口细菌复发的较少，并推测作用机理可能是由于反应性碘物质的形成，这些碘物质的生成时间短，寿命短。Zhang等[18]发现，通过添加碘化物的增强作用也适用于由聚阳离子富勒烯衍生物介导的PACT。另外还有研究表明，吩噻嗪类染料和阳离子富勒烯都不能通过添加溴化物阴离子来增强微生物杀灭作用；然而，由UVA激发的二氧化钛纳米颗粒(大的带隙半导体)却可以通过添加溴化物来增强光活性抗菌，这种增强是通过次溴酸盐中间产物的产生而增强的[19]。

4 PACT作用机制的研究进展

PACT作用于蛋白质、脂质和核酸等多个分子靶标，具有非选择性作用。PACT的这些氧化目标主要取决于PS的各自细胞定位以及新出现的ROS的最大时限扩散长度。光敏剂的细胞定位与光敏剂的化学结构(例如分子大小、电荷、亲脂性)、浓度、溶剂以及细胞壁的结构有关。例如，1O2只有3～4 ms的短寿命，所以1O2的扩散长度不超过0.3 mm，并取决于周围的介质。目前，对于PACT的作用机制尚不完全清楚，众说纷纭，大致可分为以下几类。

4.1PACT破坏生物膜系统 微生物生物膜是由自产聚合物基质包围的微生物细胞的集合，存在单物种和多物种生物膜，生物膜可附着在宿主的表面，也可不附着在宿主的表面，它们主要位于宿主组织或分泌物中。据研究表明由生物膜引起的感染约占人类所有细菌和真菌感染的80%[20]。Zarnowski等[21]发现白色念珠菌耐药性与生物膜形成有关，Chandra等[22]推测其耐药机制主要与药物外排泵和细胞膜甾醇的变化有关。Luke-Marshall等[23]发现在二氢卟吩e6的介导下，PACT对浮游培养物和卡他莫拉菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的生物膜都具有显著的杀菌活性。Li等[24]在亚甲基蓝和孟加拉玫瑰红的介导下，通过添加碘化钾在激光共聚焦显微镜下观察PACT对粪肠球菌的杀伤作用，结果显示以生物膜形式存在的粪肠球菌被有效清除。Pinto等[25]证明在甲苯胺蓝O的介导下，PACT作用可以抑制白色念珠菌在不同发育阶段产生的生物膜的生存能力，Quishida等[26]得出了相似的结论，即在姜黄素的介导下，PACT作用可以抑制白色念珠菌、光滑念珠菌和变形链球菌在不同发育阶段产生的生物膜的生存能力。

4.2PACT破坏细胞壁结构 张子平等[27]观察到5-氨基酮戊酸介导的PACT作用，使得白念珠菌细胞肿胀变形，细胞壁结构不完整，并推测PACT作用对白念珠菌的细胞壁结构具有一定的影响。林一勤[28]探讨了在新亚甲基蓝的介导下，PACT对多重耐药鲍曼不动杆菌的杀伤作用，结果显示新亚甲基蓝的浓度越高，杀伤作用越大，用透射电子显微镜观察发现细菌的细胞壁结构被明显破坏，因此推测PACT的作用机制是通过破坏细菌的细胞壁结构，来达到灭菌的目的。任雅清等[29]推测在血啉甲醚的介导下，PACT杀灭大肠杆菌的作用机制是选择性的攻击细菌细胞的细胞壁，致使细胞膜损伤、脂质过氧化、细胞壁上蛋白质变性，进而达到灭菌的效果。

4.3PACT破坏细菌遗传物质 相关研究证明PACT可以破坏细菌的DNA结构。Sudhamani等[30]发现光敏剂Co(Ⅱ)配合物介导的PACT灭活大肠杆菌的效果良好，并通过电子吸收光谱法发现Co(Ⅱ)配合物对双链DNA的沟槽结合倾向，通过凝胶电泳法证明Co(Ⅱ)配合物能诱导DNA裂解。刘汉杰等[31]证明在单核钌(Ⅱ)多吡啶钌配合物介导下，PACT对大肠杆菌的灭活是配合物通过嵌入DNA双链内部，造成切割降解作用，以此为基础，配合物能够干扰细菌的转录过程，抑制细菌生长。Märtensson等[32]同样证实了在单核钌(Ⅱ)多吡啶配合物介导下，PACT对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的灭活是配合物与DNA结合的作用。

4.4PACT破坏细菌毒力因子 近年来一些研究表明PACT不仅能够杀灭细菌，还能使细菌的毒力因子失活。Tubby等[33]使用665 nm的激光介导亚甲基蓝，可以降低金黄色葡萄球菌的毒力，并能有效地杀灭金黄色葡萄球菌，α-溶血素和鞘磷脂酶的失活不受人血清的影响，表明PACT可能对体内的这些毒素有效。PACT还能影响两种关键的细菌毒力因子——脂多糖和蛋白酶的效价。Bartolomeu等[34]研究结果表明，部分外源性毒力因子的表达受PACT的影响，产肠毒素菌株对PACT的敏感性高于非产肠毒素菌株，且存活的细菌没有产生耐药性；与传统抗生素相反，PACT抑制了毒力因子的表达，有效地灭活了高毒力金黄色葡萄球菌菌株和低毒力金黄色葡萄球菌菌株，也灭活了对抗生素敏感和耐药的金黄色葡萄球菌菌株，并且在至少10个连续治疗周期后不产生耐药性，因此，这种疗法可能成为一种很有前途的来控制病原微生物的抗生素替代品。

5 展 望

综上所述，尽管PACT灭菌尚未在临床上推广应用，但大量体外研究显示，与抗生素相比PACT在抗菌方面有着明显的优点，即选择性高，杀菌范围广，毒副作用小，极少诱导耐药性等。随着对PACT的进一步研究，PACT面临的技术问题必将得到解决，相信在不久的将来，PACT将应用于临床，成为消灭细菌感染的主要方法。