卵母细胞样细胞体外产生的研究进展

张 荣，李 宁(综述)，杨秋云，刘广芝(审校)

(1.河南省人民医院妇产科，河南 郑州 450066；2.河南省人民医院国际医疗中心，河南 郑州 450003；3.河南省人民医院干细胞研究中心，河南 郑州 450003)

早发性卵巢功能不全是导致女性不孕的常见原因之一，其发生机制尚不明确，激素替代治疗仅能缓解症状而不能解决患者生育力下降。虽然目前尚未获得人类干细胞体外诱导分化的功能成熟的卵子，但在这一技术对解决女性生育力下降问题有应用潜力。将不同物种来源的干细胞诱导分化为原始生殖细胞样细胞(primordial germ-like cells，PGCLCs)、卵泡样细胞和卵母细胞样细胞(oocyte-like cells，OLCs)，可以为探索卵子的发生调控机制提供可能的细胞模型，并可能成为早发性卵巢功能不全患者潜在治疗手段，现对此领域最新进展作一综述。

1 卵巢干细胞(Oogonial Stem Cells，OSCs)

2004年Johnson等[1]的研究指出小鼠卵泡闭锁速度大于卵巢中非闭锁卵泡消耗速率，认为存在卵泡更新并提出了卵巢干细胞的概念，之后关于OSCs的存在备受争议，若可以确定OSCs的存在，其具有自然向OLCs分化的能力，易在最小的培养条件下获得OLCs，可用作体外获得OLCs的良好细胞来源。许多研究证实不同物种来源(包括人[2]、羊[3]、小鼠[4]等)的OSCs是存在的：机械法或酶消化法处理卵巢皮质碎片后再分选DEAD-box containing ATP-dependent RNA helicase(DDX-4)阳性细胞[2]，由此获得的细胞能够表达生殖细胞特异性标记物且具有有丝分裂能力。然而2020年Wagner等[5]对人卵巢上皮组织进行的单细胞全转录组分析和抗原分析谱表明卵巢上皮组织中的细胞包括卵母细胞、颗粒细胞、免疫细胞、内皮细胞、血管周围细胞和基质细胞，而分选出的DDX-4阳性细胞并非OSCs而是血管周围细胞。由于单细胞分析的精确性，这一结果不支持OSCs的存在，但DDX-4阳性细胞在一定条件下诱导产生了表达生殖细胞标记物的细胞，卵巢上皮组织中的DDX-4阳性细胞是否是OSCs仍需继续进行深入的研究。Silvestris等[2]从育龄期及绝经后女性卵巢上皮中分选出DDX-4阳性细胞，通过进一步测定分期特异性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen 4，SSEA-4)的表达评估育龄期和绝经期妇女来源的OSCs功能，绝经后妇女SSEA-4的表达较育龄期女性低，但两组均具有分化为单倍体OLCs的能力，在添加某些细胞因子条件下培养3周后得到表达生长分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF-9)、突触复合蛋白3(synaptonemal complex protein 3，SYCP3)、发育多能相关蛋白3和其他生殖细胞表面标志物的OLCs，OLCs培养两组比较差异无统计学意义。Zou等[6]报道了不同诱导办法对雌性生殖干细胞产生OLCs的影响，结果显示，细胞先应用悬滴法进行气液界面培养再与颗粒细胞共培养后产生了功能成熟的GV期卵母细胞。现仍需更多的研究确定OSCs的存在，一旦证实其存在于卵巢中，即可为恶性肿瘤女性患者化疗前生育力保存提供方法，并可能成为治疗早发性卵巢功能不全的新型干细胞。

2 非卵巢来源干细胞

非卵巢来源干细胞包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)及皮肤衍生干细胞(skin-derived stem cells，SDSCs)等。此类干细胞虽然具有向生殖细胞分化能力，但需要提供特定的微环境。在卵泡成熟过程中，卵泡液内富含蛋白质、多糖、类固醇激素、生长因子、活性氧等，有利于卵母细胞的生长发育，因此在培养基中单独或混合使用不同浓度(5%～25%)的人、牛和猪的卵泡液以模仿此微环境，再添加分化诱导剂，如骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)家族成员，视黄酸(retinoic acid，RA)和激活素A，成功获得PGCLCs、滤泡样细胞(follicle-like cells，FLCs)或OLCs[7]。卵母细胞的生长发育还取决于周围是否存在促进其生长的健康细胞(例如颗粒细胞，卵泡膜细胞和卵丘细胞)，为了满足这一要求，有研究采用共培养策略以获得各种干细胞来源的体外衍生OLCs[8]。

2.1ESCs ESCs经PGCLCs诱导产生OLCs是比较常用的方法，通过将ESCs诱导形成胚状体后分选PGCLCs，再通过添加卵泡液或共培养等办法诱导产生OLCs。Tanaka等[9]利用小鼠ESCs诱导产生PGCLCs后在不同培养条件下经体外分化、体外生长和体外成熟得到功能成熟的卵子并在体外受精后产生健康的后代。2017年Jung等[10]研究显示，在hESCs过表达生殖细胞特异性RNA结合蛋白deleted in azoospermia-like(DAZL)和Boule(DAZ家族成员之一)，多能性标记物八聚体结合转录因子(octamer-binding transcription factor-4，OCT4)、同源域蛋白(Nanog)等下调，减数分裂标志物PR结构域锌指蛋白9基因及减数分裂特异性蛋白MLH1的上调，表明其使ESCs退出多能性并进入减数分裂，再添加GDF9、骨形态发生蛋白15(bone morphogenic protein，BMP15)后细胞被进一步诱导形成卵泡样细胞，包括卵母细胞和颗粒细胞。转录组分析、卵泡标记物免疫染色和移植实验表明，诱导所得的卵泡样细胞与体内类似。2020年Malik等[11]将山羊ESCs用骨形态发生蛋白4(bone morphogenic protein，BMP4，)诱导后形成卵丘-卵母细胞复合物，该细胞复合物表达卵母细胞特异性标记物。而且在蛋白和mRNA水平均检测到原始生殖细胞特异性标记物DDX-4、DAZL、STELLA的表达。虽然不同物种来源的ESCs均有诱导分化为OLCs的报道，但是其具体机制仍不清楚，需要进行更多更深入的研究。

2.2iPSCs iPSCs通过外源性基因转染的办法使体细胞去分化成为干细胞，已报道的体细胞包括皮肤成纤维细胞、外周血细胞、尿液细胞[12]，八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor-4，OCT4)、LIN28、性别决定区域Y同源盒基因2(Sex-determining region Y-bos2，SOX2)、NANOG在重编程过程中发挥了重要作用。人雄性生殖细胞可由多能干细胞(iPSCs/ESCs)产生，并在体内分化为精母细胞样细胞，但是iPSCs向雌性生殖细胞方向分化仍有许多问题需要解决。2017年Kojima等[13]用“两阶段”诱导法将iPSCs诱导分化为PGCLCs，先将iPSCs预诱导为早期中胚层样细胞，再用添加了白血病抑制因子、骨形态发生蛋白4、干细胞因子、表皮生长因子的培养基诱导分化得到PGCLCs，但是进一步诱导产生雌性生殖细胞一直以来未取得进展。2017年有研究报道了小鼠iPSCs来源的PGCLCs在与小鼠卵巢体细胞形成的重组卵巢共培养后形成功能成熟的卵细胞，并产生健康后代[14]。2018年Yamashiro等[15]阐明将来源于人iPSCs的PGCLCs与小鼠胚胎卵巢体细胞重组的异种卵巢共培养4个月可获得卵母细胞样细胞，其表现了表观遗传重编程范围内的DNA去甲基化，部分无活性的X染色体有进行性去甲基化和再激活，但不表达γH2AX、DMCI和SYCP1蛋白，表明诱导产生的卵母细胞未进入减数分裂。2020年Yamashiro等[16]的进一步研究表明将iPSCs诱导为PGCLCs后移植到缺乏内源性精子发生的新生小鼠睾丸中，有助于精子发生，由iPSCs诱导产生的PGCLCs在气液界面条件下与小鼠胚胎卵巢体细胞聚集形成异种重组卵巢共培养约4个月后产生表达视黄酸激活基因8(retinoic acid gene 8，STRA8)、REC8(减数分裂特异性基因)、染色体1B的结构维持基因(SMC1B)等视黄酸反应性胎儿生殖细胞的特征基因，阐明产生了进入减数分裂期的卵母细胞前体细胞。到目前为止，这是唯一一种从人iPSCs中产生进入减数分裂的卵母细胞样细胞的方法，可此办法的诱导效率仅为10%，还需进行更多深入的研究明确发生机制并提高诱导效率。

2.3MSCs 来源包括脐带、骨髓、脂肪、月经血、羊膜等，可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等，在造血细胞移植、骨软骨损伤修复、炎性疾病、自身免疫性疾病等发面取得了巨大进展[17]。在女性生殖领域，MSCs与羊水干细胞多被用作早发性卵巢功能不全的细胞疗法并有确切效果[18-21]，几乎没有向OLCs诱导的报道。Kim等[22]将在3D培养系统中培养的脐带MSCs移植入切除卵巢后的大鼠中，2周后实验组的雌二醇水平较对照组高，且mRNA和蛋白水平Nanos3，新生儿卵巢同源基因和LIM同源盒基因8的表达显著增加，说明MSCs显著改善卵巢功能。2019年Mirzaeian等[8]将小鼠腹膜MSCs与人卵泡液、卵丘细胞共培养获得阳性表达卵母细胞标记物透明带标记蛋白3、GDF9，生殖细胞标记物DDX-4、DAZL的OLCs。2020年Alifi等[23]从健康人胎盘获得羊膜MSCs，用视黄酸处理14 d后检测原始生殖细胞标记物C-kit，SSEA4，DDX-4高表达，OCT4低表达，说明诱导产生PGCLCs。Taheri等[7]从应用辅助生殖技术的妇女卵泡液中分离MSCs并用BMP15诱导培养21 d，获得了阳性表达透明带标记蛋白2、透明带标记蛋白3的OLCs，但是不具备完善的生殖细胞功能，但是同类型研究报道较少。由于MSCs的间质组织分化特性，很少用其诱导产生OLCs，但是用于治疗早发性卵巢功能不全的效果已经得到有力的证实，或该进行更多临床实验。

2.4SDSCs 已有来源于小鼠和猪SDSCs诱导分化为OLCs的报道。Dyce等[24]的前期实验提出通过分化小鼠SDSCs来形成PGCLCs和更高级的OLCs，但是减数分裂无法启动，后期实验提出RA是功能性配子形成的关键驱动力，在干细胞向生殖细胞分化过程中添加RA可改善OLCs进入减数分裂的过程。Yan等[25]的研究结果也表明RA可以降低U0126(一种细胞外信号调节激酶特异性抑制剂)活性，进而细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达增加，故促进PGCLCs增殖。总之，目前的研究说明体外培养体系不足以支持从SDSCs诱导产生成熟的功能完备的卵母细胞。

3 极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)

VSELs是最原始的干细胞，与ESCs相比，在表观遗传和发育上更成熟，其来源广泛，包括卵巢/睾丸、骨髓、外周血等，直径3～7 μm，故在细胞分选上有较高要求，常因离心机转速选择不当致细胞丢失。VESLs优势有：表达OCT-4A、SOX-2、NANOG、SSEA-1(人类中SSEA-4)等类似ESCs的多能性基因，表达OCT-4B、SCA-1(人类中CD133)、DDX-4等PGCs特异性表面标志物、在不使用细胞饲养层或病毒转染即可具有离体增殖能力、在化疗后仍可存活并保留向OLCs分化能力[26]。成人体内的VSELs处于静止状态，当有器官损伤时活化的VSELs可通过动员外周血促进受损器官组织的再生，由于VSELs的静止性质，其可以避免核和线粒体突变，因此可以作为生殖医学中更安全的治疗选择[27]。不同组织来源的VSELs具有类似的mRNA、蛋白表达谱，其在生物学上无明显差异。Virant-Klun[28]检查了由VSELs诱导获得的OLCs细胞受精能力，结果显示OLCs能识别精子并释放出透明带样结构，但不能进行受精，表明由VSELs诱导分化获得的OLCs功能不健全。也有报道表明在复发性卵巢癌腹水中的细胞主要为VSELs，提示VSELs在卵巢癌发生中可能有一定作用。在VSELs分选、诱导分化为OLCs并使其具有成熟功能等方面仍需进行更多的探索。

4 总结与展望

干细胞体外分化为OLCs需要一系列过程，包括多能性退出、形态改变(圆形卵母细胞样细胞形态)、早期和晚期PGCLCs标志物表达、减数分裂进入、卵母细胞特异性标记物表达、透明带的发育以及卵丘-卵母细胞复合物的形成和细胞大小的生长。在特定的条件下干细胞具有分化为许多谱系的能力，干细胞来源的选择与分化方案的选择同等重要，在开始任何谱系特异性分化之前，需选择最合适的细胞来源。OLCs体外诱导来源主要包括OSCs、ESCs、iPSCs、MSCs、VSELs等。OSCs有自发向OLCs分化的潜力，具有更高的分化效率，在确定其存在后可以成为新型干细胞模型及治疗选择。与MSCs相比，ESCs和iPSCs具有更大的OLCs分化能力，iPSCs来源于容易获得的体细胞且具有类似于ESCs的特征，避免了伦理问题，ESCs及iPSCs的安全性均有待研究。此外，极小胚胎样干细胞也被用于体外衍生OLCs，VSELs可以在化疗中存活，这使极小胚胎样干细胞成为更有价值的细胞来源，但是，由于细胞产率低且需要复杂的分离方法、确认标准，VSELs的规模有限，利用其产生功能成熟的卵母细胞仍有很多的困难与挑战。尽管有这些进展，利用干细胞技术探究卵母细胞的发生调控机制仍有很多空白。在治疗早发性卵巢功能不全等疾病中，干细胞的直接使用(未分化状态)由于其低免疫原性，旁分泌信号和归巢能力而也仍有很大争议。总之，干细胞体外诱导分化产生卵子的过程中缺乏体内研究、无法产生健康后代，研究人员正在努力标准分化方案，使其更安全、更理想、更高效，OLCs在应用于临床之前，仍需进行更多更深入的研究使其发挥全部功能。