芍药甘草汤灌肠治疗大鼠氯胺酮相关性膀胱炎的实验研究*

郑东翔，钟喨，黄智峰，曾建峰，吴松

（中山市中医院泌尿外科，中山 528400）

氯胺酮是一种临床常见的麻醉药物，主要应用于小儿外科麻醉[1]。由于氯胺酮的兴奋及致幻作用，其逐渐成为娱乐场所滥用的新型毒品[2]。氯胺酮滥用患者多出现明显的泌尿系统损害，临床表现为尿频、尿急、血尿及膀胱区疼痛等，称为氯胺酮相关性膀胱炎（KC）[3]。目前针对KC的治疗药主要包括抗胆碱药物、非甾体类及甾体类抗炎药物，但部分患者药物疗效不佳[4]。多项研究发现，氯胺酮能够通过多种通路增强氧化应激反应，从而导致膀胱炎症的发生。在氯胺酮诱导的KC大鼠模型中，可见膀胱组织环氧化酶-2（COX-2）、一氧化氮合酶（iNOS）和内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）的表达上调，这些氧化应激酶的增加可能在KC发展中起到重要作用[5]。氯胺酮还可引起核因子κB（NF-κB）向核内易位，从而激活COX-2，导致大鼠膀胱炎症[6]。另有研究发现[7]，氯胺酮可升高线粒体和内质网介导的氧化应激酶活性，从而导致溃疡性膀胱炎和膀胱细胞凋亡。中医认为KC归属为“淋症”范畴，治以清热利湿、活血祛瘀、通淋止痛为主。芍药甘草汤有养血敛阴，缓急止痛之效，为临床治疗石淋绞痛的常用方。现代药理学研究证明[8]，其具有抗氧化、镇痛止痉及抗炎等作用，对尿路感染及尿路结石患者具有较好的疗效。本研究观察芍药甘草汤灌肠对KC模型大鼠的治疗作用，并通过NF-κB/COX-2/Nrf2通路探讨其抑制氧化应激及炎症反应，改善膀胱功能，减轻膀胱组织损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠共40只，SPF级，体质量（200±20）g，饲养于室温 18～25℃，相对湿度45%～55%环境中，实验前适应性饲养1周。

1.2 药物与试剂 盐酸氯胺酮注射液（2 mL∶0.1 g）购自武汉久安药业有限公司，批号：19011015。左氧氟沙星胶囊（100 mg/片）购自安徽三精万森制药有限公司，批号：181229。芍药甘草汤处方为：白芍30 g，生甘草10 g，由中山市中医院门诊部药房提供实验用生药，经广州中医药大学张丹雁教授鉴定，分别为毛茛科芍药属植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根及豆科甘草属植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根及根茎。药材参照《中国药典》2015年版现行标准，经薄层色谱法鉴别，甘草以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，甘草酸单铵盐（质量分数98.0%）为对照品；白芍以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，芍药苷（质量分数98.8%）为对照品，结果均具有鉴别特征，符合国家标准，可以入药。实验前将药材加水煎煮浓缩，贮存于4℃冰箱备用。苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附法（ELISA法）检测试剂盒购自上海酶科生物科技有限公司；总蛋白提取试剂盒购自美国Sigama公司，Anti-NF-κB p65、Anti-COX-2、Anti-Nrf2、Anti-βactin购自美国 R＆D 公司，TransAMTM NF-κB p65、Nrf2活性检测试剂盒购自Active Motif公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组与给药 将40只SD大鼠随机分为4组：空白组、模型组、左氧氟沙星组、芍药甘草汤组，每组10只。以左氧氟沙星为阳性对照组，模型组、左氧氟沙星组及芍药甘草汤组采用氯胺酮（30 mg/kg）腹腔注射制备KC模型，每日1次，持续12周。造模停药3 d后，胶体金法检测大鼠尿液标本中氯胺酮浓度，质控区（C）检测线处出现红色条带，而测试区（T）未出现紫红色条带为阳性，证实造模成功。模型制备成功后，芍药甘草汤组按生药量3.6 g/kg保留灌肠，药液临用前用生理盐水稀释至终浓度为0.72 g/mL，加热至30℃，采用2 mL注射器连接小儿导尿管缓慢推入。左氧氟沙星组给予40 mg/kg灌肠，正常组给予生理盐水灌肠，给药体积均按5 mL/kg计，每日1次，持续4周。

1.3.2 膀胱尿流动力学检测 各组大鼠腹腔注射水合氯醛（200 mg/kg）麻醉，固定大鼠四肢，行耻骨上缘纵向切口，以直径1 mm的硬膜外导管经尿道插入膀胱，导管连接三通管，三通管与微量灌注泵相连，用生理盐水以0.2 mL/min速率灌注，另一端连接尿动力检测仪的压力换能器，记录大鼠膀胱残余尿量、膀胱最大容量、最大膀胱内压及膀胱顺应性变化，膀胱顺应性=膀胱最大容量/最大膀胱内压。

1.3.3 疼痛阈值检测 参照文献[9]方法，将大鼠单独放置于有金属网格的透明塑料测试笼，适应30min后，分别以 1.0、2.0、4.0、8.0、15.0、20.0 g的纤维细丝依次刺激大鼠肛门与尿道口之间区域，每根纤维刺激10次，每次持续1～2 s，大鼠出现弓背、跳跃，舔咬下腹部等动作为有反应，将反应次数大于5次的纤维力度定为大鼠的疼痛阈值。

1.3.4 HE染色观察膀胱组织病理学变化 取部分膀胱组织于4%多聚甲醛中固定，脱水、透明后石蜡包埋，作5 μm厚切片，再经烤片、脱蜡至水、HE染色、70%盐酸乙醇分化、脱水透明、中性树胶封片等操作后完成制片，光学显微镜下观察膀胱组织的形态学变化。

1.3.5 血清中炎性因子含量检测 大鼠眼球取血，离心后取血清于-20℃冰箱保存待测。血清常温下放置1h后3 000 r/min离心15min，离心半径13.5cm，加入样品稀释剂 40 μL，抗体 100 μL，血清 10 μL，置于37℃孵育1 h，洗涤液清洗5次，加入显色液100 μL，37 ℃避光孵育 15 min，加入终止液 50 μL，于酶标仪450 nm下检测各反应孔OD值，绘制标准曲线，计算血清中白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及TNF-α的含量。

1.3.6 膀胱组织中 NF-κB p65、COX-2、Nrf2 蛋白表达检测 取大鼠膀胱组织100～200 mg，剪碎后置于裂解液中，使用组织匀浆器冰上匀浆，4℃离心机12 000 r/min离心20 min，离心半径8 cm，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。进行制胶、上样、电泳、转膜和封闭后，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜。ECL发光液孵育后，凝胶成像分析系统曝光图像，计算目标蛋白与相应内参的光密度比值，分析NF-κB p65、核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）、环氧化酶-2（COX-2）的蛋白含量。

1.3.7 膀胱组织中NF-κBp65、Nrf2的活性检测 将蛋白提取液A和B分别加入蛋白酶抑制剂混匀备用，大鼠膀胱组织解冻后，取100～200 mg加入预冷磷酸盐缓冲液（PBS）匀浆，4℃离心机离心5 min，离心半径8 cm，后弃上清液，加入蛋白提取液A，高速涡旋震荡，PBS洗涤后离心弃上清液，加入蛋白提取液B，高速涡旋震荡，离心后吸取上清液即得到核蛋白。采用BCA法测定核蛋白浓度，参照Trans AMTM检测试剂盒说明书测定膀胱组织NF-κB p65、Nrf2的DNA活性：分别设置空白孔、样本孔、特异性结合孔、非特异性竞争孔和阳性对照孔，按操作步骤加入反应试剂，于450 nm下测定各孔OD值，根据标准曲线计算NF-κB p65、Nrf2相对结合活性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件进行分析，实验数据以均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱尿动力学检测结果 模型组大鼠膀胱最大容量、残余尿量及膀胱顺应性较空白组显著增加，最大膀胱内压显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。左氧氟沙星组及芍药甘草汤组大鼠膀胱最大容量、残余尿量及膀胱顺应性均低于模型组，最大膀胱内压均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠尿动力学指标比较（±s）Tab.1 Comparison of urodynamic indexes of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 膀胱最大容量（mL） 最大膀胱内压（cm H2O） 残余尿量（mL） 膀胱顺应性（mL/cm H2O）空白组 10 1.41±0.36 85.08±11.21 0.15±0.10 0.017±0.003模型组 10 4.93±1.10* 46.36±8.07* 1.98±0.31* 0.106±0.002*左氧氟沙星组 10 2.73±0.37# 65.14±9.69# 0.67±0.17# 0.042±0.002#芍药甘草汤组 10 2.35±0.40# 68.23±8.26# 0.50±0.23# 0.034±0.004#

2.2 疼痛阈值比较 模型组大鼠与空白组大鼠比较，疼痛阈值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。左氧氟沙星组及芍药甘草汤组大鼠与模型组相比，疼痛阈值明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表2 各组大鼠疼痛阈值比较（±s）Tab.2 Comparison of pain threshold of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠疼痛阈值比较（±s）Tab.2 Comparison of pain threshold of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 疼痛阈值（g）空白组 10 13.20±4.87模型组 10 1.90±1.20*左氧氟沙星组 10 6.40±5.04#芍药甘草汤组 10 7.00±4.81#

2.3 膀胱组织病理形态学观察 光镜下可见，空白组大鼠膀胱平滑肌肌束排列有序，肌束间结构紧密，膀胱组织未见异常变化。模型组大鼠与空白组相比，膀胱平滑肌明显增生肥大，固有层充血、水肿，可见大量炎性细胞浸润。左氧氟沙星组及芍药甘草汤组大鼠膀胱组织损伤较模型组减轻，平滑肌增生肥大明显减轻，固有层可见少量炎性细胞浸润，膀胱炎症减轻。见图1。

图1 各组大鼠膀胱组织病理形态学改变（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of bladder of rats(HE，×200)

2.4 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子含量 模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量较空白组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。左氧氟沙星组及芍药甘草汤组大鼠与模型组比较，IL-1β、IL-6、TNF-α的含量有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表3 各组大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达（±s）Tab.3 IL-1β、IL-6、TNF-α in serum of rats in each group（±s）ng/mL

表3 各组大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达（±s）Tab.3 IL-1β、IL-6、TNF-α in serum of rats in each group（±s）ng/mL

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 IL-1β IL-6 TNF-α正常组 10 0.102±0.014 101.59±33.28 1.352±0.231模型组 10 0.358±0.051*190.85±35.76*2.935±0.304*左氧氟沙星组 10 0.174±0.046# 132.50±41.26#1.763±0.415#芍药甘草汤组 10 0.162±0.053# 125.38±32.51#1.658±0.280#

2.5 膀胱组织中 NF-κB p65、COX-2、Nrf2 的蛋白表达 模型组大鼠膀胱组织中NF-κB p65、COX-2的蛋白表达显著升高，而Nrf2的表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，左氧氟沙星组及芍药甘草汤组大鼠膀胱组织中NF-κB p65、COX-2的蛋白表达均明显降低，Nrf2的表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.6 膀胱组织NF-κB p65、Nrf2的DNA结合活性情况 模型组膀胱组织核蛋白中NF-κB p65的DNA结合活性显著升高，Nrf2的结合活性明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，左氧氟沙星及芍药甘草汤明显降低了NF-κB p65的DNA结合活性，升高了Nrf2的结合活性（P＜0.05）。见表 4。

表4 各组大鼠膀胱组织NF-κB p65、Nrf2的DNA结合活性（±s）Tab.4 DNA binding activity of NF-κB p65 and Nrf2 in bladder tissue of rats in each group（±s）ng

表4 各组大鼠膀胱组织NF-κB p65、Nrf2的DNA结合活性（±s）Tab.4 DNA binding activity of NF-κB p65 and Nrf2 in bladder tissue of rats in each group（±s）ng

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 NF-κB p65 Nrf2正常组 10 0.213±0.036 0.384±0.029模型组 10 0.488±0.072* 0.120±0.014*左氧氟沙星组 10 0.251±0.028# 0.246±0.027#芍药甘草汤组 10 0.259±0.043# 0.253±0.031#

3 讨论

氯胺酮具有麻醉、镇痛效用，常作为麻醉药物用于临床外科手术中，还可用于顽固性癌性疼痛的止痛治疗[1]。由于氯胺酮的中枢神经兴奋及致幻作用，使其成为娱乐场所滥用的新型毒品之一，俗称“K粉”。长期吸食氯胺酮会造成神经系统、心血管系统、泌尿系统等多系统组织器官的毒性损害[2]。近年来，氯胺酮相关性泌尿系统损害逐渐受到国内外学者的关注，尤其对KC的研究逐渐增多。KC临床表现为尿频、尿急、血尿及膀胱区疼痛等症状，目前的治疗方法以戒断氯胺酮为主，配合抗胆碱药物、非甾体类及甾体类抗炎药物，但仍有部分患者药物疗效不佳[3-4]。中医将KC归属为“淋症”范畴，症见小便短赤频数，淋沥刺痛，少腹拘急，或痛引腰腹，治以清热利湿，通淋止痛为主。芍药甘草汤最早记载于张仲景《伤寒论》，由白芍、甘草两味药组成。芍药性酸寒，具有敛阴养血之效，甘草性甘温，有缓急止痛之功，两者配伍可用于治疗肝脾不和，脘腹疼痛，及筋脉失养，腿脚挛急等症。后世医家用其治疗石淋绞痛，发现止痛效果突出[10]。现代药理学研究证实本方具有明显的抗氧化、镇痛止痉及抗炎等作用[6]，方中有效成分芍药苷能显著抑制TNF-α的表达，减少炎症细胞浸润，从而缓解炎性疼痛[11]。甘草酸能够降低炎性细胞因子IL-6、IL-10的水平，提高抗氧化能力，缓解炎症症状[12]。

KC发生的确切机制尚不清楚，目前发现的可能机制主要有膀胱黏膜毒性损伤、自身免疫反应及氧化应激等[13-15]。氧化应激相关酶COX-2可能在KC的发生过程中具有重要作用[16]。COX-2能够催化花生四烯酸转化为前列腺素，进而诱导炎症反应发生[17]。研究发现[18]，氯胺酮能够促进膀胱组织中COX-2的表达，其表达的增加可能是通过NF-κB通路实现的。NF-κB是炎症过程中炎症介质的重要转录因子，与IL-6、TNF-α等多种促炎细胞因子的表达密切相关[19]。Nrf2则是调控抗氧化基因的重要调节因子，能够抑制氧化应激和NF-κB激活对炎症反应起到保护作用[20]。由此可见，NF-κB/COX-2/Nrf2通路在机体炎症反应过程中起着重要作用。

中药保留灌肠是一种中医外治疗法，能够使药物通过直肠静脉丛迅速吸收，并可经门静脉进入体循环，达到整体治疗的效果，与口服给药相比具有药物利用率高，不良反应少的优势[21]。本研究在前期临床试验中采用芍药甘草汤灌肠结合常规治疗方案，发现对KC患者效果显著，患者经治疗后临床症状明显减轻[22]。在此基础上，本研究通过腹腔注射氯胺酮建立大鼠KC模型，探讨芍药甘草汤灌肠治疗对KC的作用机制。实验结果显示，芍药甘草汤灌肠能够降低膀胱最大容量、残余尿量及膀胱顺应性，升高最大膀胱内压，并提高大鼠疼痛阈值，提示其能改善大鼠下尿路功能，减轻膀胱区及尿道疼痛。病理学结果显示，芍药甘草汤治疗后大鼠膀胱组织损伤明显改善，炎性细胞浸润减少，同时，芍药甘草汤能够有效降低IL-1β、TNF-α、IL-6炎症因子水平，降低膀胱组织中NF-κB p65、COX-2的蛋白表达上调Nrf2的表达。模型组大鼠膀胱组织NF-κB p65 DNA结合活性较空白组显著增高，Nrf2结合活性明显降低，提示氯胺酮通过激活NF-κB通路，促进了大鼠膀胱组织氧化应激的发生。芍药甘草汤治疗降低了NF-κB p65的脱氧核糖核酸结合活性，使Nrf2的结合活性增高，表明芍药甘草汤能够通过激活Nrf2增强大鼠抗氧化能力，抑制NF-κB介导的氧化应激及其诱导的炎症反应，从而起到对KC的治疗作用。