miR-625靶向HMGA1对食管癌细胞生物学行为的影响及机制

李大伟，刘 磊

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，根据病理类型可分为食管鳞状细胞癌和食管腺状细胞癌，约90%的食管癌患者为食管鳞状细胞癌[1]。随着医疗技术的不断发展，临床在食管癌的诊断和治疗方面取得了显著进步，但食管癌患者预后仍不令人满意，食管癌发病机制尚有待进一步阐明[2]。微小RNA(miRNA)是一类小核苷酸非编码RNA短链，介导细胞增殖、凋亡和迁移等生命活动，参与肿瘤发生和发展[3]。刘莎莎等[4]研究发现，miR-625在食管鳞状细胞癌中发挥抑癌基因作用，可能为食管鳞状细胞癌潜在的治疗靶点和预后判断标志物。高迁移率族蛋白A1(HMGA1)是miR-625的靶基因，ZHOU等[5]研究表明，miR-625可靶向HMGA1抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。然而，miR-625靶向HMGA1对食管癌细胞生物学行为的影响及机制现尚不清楚。因此，本研究探讨miR-625靶向HMGA1对食管癌细胞生物学行为的影响及机制，以期为食管癌早期临床诊断及靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织和细胞来源：收集2018年3月—2019年3月经手术切除的食管癌组织及癌旁组织(距癌组织≥5 cm)标本各35例，其中男21例，女14例；年龄(63.75±12.36)岁；TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期21例，Ⅲ期10例。患者术前均未接受放化疗和其他治疗，无其他重大疾病史。本研究经医院医学伦理委员会审批同意执行。食管癌细胞系KYSE150、KYSE30、ECA109、EC9706和正常食管上皮细胞HET-1A购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Gibco)，CCK-8试剂(上海碧云天生物)，脂质体2000试剂盒、Trizol试剂、pcDNA3.1载体(美国Invitrogen)，SYBR Premix Ex Taq kit(北京宝日医生物)，ECL试剂盒(武汉博士德生物)，Cyclin D1(ab16663)、p21(ab188224)、E-cadherin(ab40772)、N-cadherin(ab98952)和Vimentin(ab137321)抗体(美国Abcam)，双荧光素酶报告基因检测系统(美国Promega)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和转染：以含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞，培养条件为37 ℃、5%CO2。待细胞密度达80%时，添加胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养，取对数生长期细胞进行实验。采用脂质体2000试剂盒，待细胞密度达60%时，将细胞分为mimic NC组、miR-625 mimic组、inhibitor NC组、miR-625 inhibitor组及pcDNA3.1-HMGA1组、miR-625+HMGA1组，分别进行脂质体转染，其中mimic NC组加入miR-625 mimic NC质粒，miR-625 mimic组加入miR-625 mimic质粒，inhibitor NC组加入miR-625 mimic NC质粒，miR-625 inhibitor组加入miR-625 inhibitor质粒，pcDNA3.1-HMGA1组加入pcDNA3.1-HMGA1质粒，miR-625+HMGA1组共转染miR-625 mimic质粒与pcDNA3.1-HMGA1质粒，转染6 h后更换新鲜培养基继续培养，转染过程均严格按照脂质体2000试剂盒说明书进行。

1.2.2RT-qPCR检测miR-625和HMGA1 mRNA表达：取适量组织和细胞，添加Trizol试剂提取总RNA，分析其纯度、浓度和完整性，逆转录合成cDNA模板链，再添加SYBR Premix Ex Taq kit进行RT-qPCR扩增。扩增条件：95 ℃10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，最后以72 ℃延伸10 min。miR-625、U6、HMGA1和GADPH引物序列由南京金斯瑞公司提供，以2-ΔΔCt法检测目的基因表达水平。引物序列miR-625上游：5'-GGCTAGTTCACTCCTCTCCTCC-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCAGGT-3'；U6上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；HMGA1上游：5'-TCCATTCTTCGACATCCGTCA-3'，下游：5'-GATCGTGGGCAGAACAGGAG-3'；GADPH上游：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，下游：5'-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'。

1.2.3CCK-8实验检测细胞增殖：以每孔5000个将细胞接种于96孔板，培养24 h后，添加含有10%CCK-8试剂的培养基，继续培养1 h，于490 nm处检测各孔细胞的OD值。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期：收集培养好的细胞重悬于PBS缓冲液中，加入RNA酶，室温下孵育15 min，加入PI染液，室温下避光孵育30 min，过滤后上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5Transwell小室实验检测细胞侵袭：预先将基质胶铺于Transwell小室上室，将5×104个细胞接种于上室，下室中添加含20%胎牛血清培养基，正常培养24 h后，用棉签拭去上膜表面细胞，置于甲醇中固定，结晶紫染色后，光镜下观察并计数。

1.2.6划痕实验检测细胞迁移：将1×105个细胞接种于6孔板，待细胞密度达100%时，用1 ml枪头垂直孔底于培养孔中轴划线，冲洗脱落细胞，于0和24 h时，光镜下观察并拍摄细胞划痕愈合情况。

1.2.7Western blot检测相关蛋白表达：将培养好的细胞加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上层蛋白液检测浓度，配制10% SDS-PAGE凝胶，每孔加等量蛋白样完全分离后，取出蛋白胶湿转至PVDF膜，分别孵育封闭液(含5%脱脂奶粉)、一抗(1∶1000)和二抗(1∶5000)，采用ECL试剂盒行化学发光显影。

1.2.8双荧光素酶报告基因检测验证靶向关系：经生物信息学软件Target Scan在线预测miR-625靶基因，构建含有HMGA1基因野生型(WT)3' 端非编码区(3' UTR)和突变型(MUT)3' UTR片段，并插入质粒载体。分别将miR-625 mimic、mimic-NC、HMGA1 3' UTR WT和HMGA1 3' UTR MUT质粒共转染细胞，6 h后更换为含10%胎牛血清培养基，继续培养36 h，检测各孔荧光素酶活性(相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值)。

2 结果

2.1不同组织及细胞中miR-625表达 miR-625相对表达量，食管癌组织低于癌旁组织，食管癌细胞系KYSE150、KYSE30、ECA109、EC9706低于正常食管上皮细胞HET-1A；miR-625 mimic组较mimic NC组升高，miR-625 inhibitor组较inhibitor NC组降低(P<0.05)。见图1。

图1 食管癌组织及细胞中miR-625表达1a.不同食管组织中miR-625的表达，1b.不同食管细胞中miR-625的表达，1c.转染miR-625 mimic和miR-625 inhibitor对ECA109细胞中miR-625表达的影响；与HET-1A和mimic NC组比较，aP<0.05；与inhibitor NC组比较，bP<0.05

2.2miR-625表达对ECA109细胞增殖和周期影响 与mimic NC组比较，miR-625 mimic组细胞增殖能力、处于S期细胞比例和Cyclin D1表达降低，处于G1期细胞比例和p21表达升高(P<0.05)。与inhibitor NC组比较，miR-625 inhibitor组细胞增殖能力、处于G2期细胞比例和Cyclin D1表达升高，处于G1期细胞比例和p21表达降低(P<0.05)。见图2。

图2 miR-625表达对ECA109细胞增殖和周期影响2a.miR-625表达对ECA109细胞增殖的影响，2b.miR-625表达对ECA109细胞周期的影响，2c.miR-625表达对ECA109细胞增殖相关蛋白表达的影响；与mimic NC组比较，aP<0.05；与inhibitor NC组比较，bP<0.05

2.3miR-625表达对ECA109细胞侵袭和迁移影响 与mimic NC组比较，miR-625 mimic组细胞侵袭、迁移能力和N-cadherin、Vimentin表达降低，E-cadherin表达升高(P<0.05)。与inhibitor NC组比较，miR-625 inhibitor组细胞侵袭、迁移能力和N-cadherin、Vimentin表达升高，E-cadherin表达降低(P<0.05)。见图3。

图3 miR-625表达对ECA109细胞侵袭和迁移影响3a.miR-625表达对ECA109细胞侵袭的影响,3b.miR-625表达对ECA109细胞迁移的影响,3c.miR-625表达对ECA109细胞侵袭和迁移相关蛋白表达的影响;与mimic NC组比较，aP<0.05；与inhibitor NC组比较，bP<0.05

2.4miR-625与HMGA1靶向关系 miR-625与HMGA1 3' UTR存在结合位点,见图4。与mimic NC组比较，miR-625 mimic组细胞中相对荧光素酶活性降低(P<0.05),见图5。与mimic NC组比较，miR-625 mimic组HMGA1表达降低，pcDNA3.1-HMGA1组HMGA1表达升高；与pcDNA3.1-HMGA1组比较，miR-625+HMGA1组HMGA1表达降低(P<0.05)，见图6。

图4 miR-625与HMGA1 3' UTR结合位点HMGA1为高迁移率族蛋白A1,3' UTR为3' 端非编码区

图5 双荧光素酶报告基因检测结果与mimic NC组比较，aP<0.05

图6 miR-625对细胞中HMGA1表达影响HMGA1为高迁移率族蛋白A1;6a.miR-625对细胞中HMGA1 mRNA表达的影响,6b.miR-625对细胞中HMGA1 蛋白表达的影响;与mimic NC组比较，aP<0.05；与pcDNA3.1-HMGA1组比较，bP<0.05

2.5miR-625靶向HMGA1对ECA109细胞影响 与mimic NC组比较，miR-625 mimic组细胞增殖、侵袭、迁移能力及处于S期细胞比例降低，处于G1期细胞比例增加；pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖、侵袭、迁移能力及处于G2期细胞比例升高，处于G1期细胞比例降低(P<0.05)。与pcDNA3.1-HMGA1组比较，miR-625+HMGA1组细胞增殖、侵袭及迁移能力降低，处于G1期细胞比例升高(P<0.05)。见图7。

图7 miR-625靶向HMGA1对ECA109细胞影响HMGA1为高迁移率族蛋白A1;7a.miR-625靶向HMGA1对ECA109细胞增殖的影响,7b.miR-625靶向HMGA1对ECA109细胞周期的影响,7c.miR-625靶向HMGA1对ECA109细胞侵袭的影响,7d.miR-625靶向HMGA1对ECA109细胞迁移的影响;与mimic NC组比较，aP<0.05；与pcDNA3.1-HMGA1组比较，bP<0.05

3 讨论

大量研究报道，多种miRNA在食管癌中呈异常表达，这种异常表达可能调控细胞多种病理生理学行为，参与食管癌的发生和发展[6]。ZHANG等[7]分析食管癌临床样本，发现miR-145在食管癌中表达上调，体外实验发现miR-145促进食管癌细胞的增殖和迁移，可能与靶向调控SMAD5表达有关。LANG等[8]研究发现，miR-486作为肿瘤抑制因子，可靶向调控CDK4/BCAS2抑制食管癌细胞的生长和转移。miR-625在食管癌中也发挥抑癌基因作用。本研究结果显示，miR-625相对表达量，食管癌组织低于癌旁组织，食管癌细胞系KYSE150、KYSE30、ECA109、EC9706低于正常食管上皮细胞HET-1A。WANG等[9]收集158例食管癌组织样本，检测显示miR-625在食管癌组织中表达低于正常组织，分析原因可能为靶向抑制Sox2表达，减弱食管癌细胞的增殖和侵袭。然而，miR-625是否可靶向其他基因作用于食管癌，仍有待深入分析。

恶性增殖、侵袭及转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，本研究通过CCK-8实验、流式细胞仪、Transwell小室实验及划痕实验检测细胞增殖、周期、侵袭和迁移，结果显示过表达miR-625可诱导食管癌细胞周期阻滞，抑制其增殖、侵袭与迁移，而抑制miR-625表达可逆转上述作用。Cyclin D1是重要的细胞周期调控蛋白，可促进细胞由G1期向S期转化，从而加速细胞增殖[10]。p21则是细胞周期负性调控因子，可抑制多种细胞周期蛋白和激酶的活性，限制细胞从G1期向S期转化[11]。本研究转染miR-625 mimic后，细胞中Cyclin D1表达下调，p21表达上调，提示miR-625通过调节Cyclin D1和p21表达，阻滞细胞周期进程，从而抑制食管癌细胞增殖。肿瘤细胞的侵袭和迁移机制十分复杂，涉及多个过程的相互作用，如上皮间质转化和新生血管形成等[12]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin分别是上皮间质转化过程中上皮和间质表型的标志蛋白，肿瘤细胞通过上皮间质转化获得较高的运动能力，增强侵袭与迁移[13]。本研究发现上调miR-625表达可促进细胞中E-cadherin表达，抑制细胞中N-cadherin和Vimentin表达，提示miR-625可能减少食管癌细胞上皮间质转化，从而抑制其侵袭与迁移。

HMGA1是一种非组蛋白的DNA结合蛋白，在多种恶性肿瘤中发挥致癌基因作用，可通过多种途径影响肿瘤细胞的侵袭和迁移[14]。TOYOZUMI等[15]研究发现，HMGA1在食管鳞状细胞癌中表达上调，且其高表达与患者预后不良密切相关。本研究经生物信息学软件预测显示，miR-625与HMGA1 3' UTR存在结合位点，且双荧光素酶报告基因检测、RT-qPCR和Western blot检测结果均证实，miR-625与HMGA1存在靶向关系。进一步共转染miR-625 mimic和pcDNA3.1-HMGA1观察miR-625是否可靶向HMGA1作用于食管癌细胞，结果显示pcDNA3.1-HMGA1组细胞增殖、侵袭、迁移能力及处于G2期细胞比例高于mimic NC组，处于G1期细胞比例低于mimic NC组；而miR-625+HMGA1组细胞增殖、侵袭及迁移能力较pcDNA3.1-HMGA1组降低，处于G1期细胞比例较pcDNA3.1-HMGA1组升高。提示miR-625可靶向HMGA1调控食管癌细胞的生物学行为。

综上所述，miR-625在食管癌组织和细胞中呈低表达，且可负向调控HMGA1抑制食管癌细胞的增殖、侵袭与迁移，这为食管癌的发病机制研究提供了新思路，可能有助于食管癌的早期诊断和治疗。