艾灸对膝骨关节炎模型兔软骨病理学改变及行为学改变的影响*

吴 双，邢金云，王 燕，田 薇，任秀梅

（南通大学附属医院，江苏 南通 226001）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节疼痛为主要表现，伴有局部肿胀、畸形、功能活动受限的慢性关节疾病。随着人口老龄化不断加剧，膝骨关节炎的发病率呈逐年上升趋势。流行病学显示，我国65岁以上的人群中本病的发病率高达85%[1]，严重影响了中老年人生活质量。目前国内外治疗KOA的方法众多，以非甾体抗炎药为代表的药物治疗及手术治疗较为常见，但因其副作用大、费用昂贵，临床应用具有一定的局限性。艾灸作为中医传统治疗方法，借助烧灼艾叶产生的温热效应和药理作用，安全有效，无毒副作用，可达到防病治病的目的，对膝骨关节炎的防治具有独特优势。本研究通过观察艾灸“犊鼻”“足三里”对KOA模型兔的膝关节软骨病理学及行为学的影响，以期为临床艾灸治疗膝骨关节炎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康新西兰大耳白兔40只，雌雄不限，6个月龄，体质量2.0~3.0 kg，由南通大学动物实验中心提供，动物合格证号：201829201。所有动物饲养于南通大学动物实验中心，饲养环境保持在温度23℃，湿度50%，单笼饲养，常规饮食，自由摄水。实验过程严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药物与试剂艾灸条（泰州市灸疗技术研究所泰州久火灸疗用品有限公司，产品标准号：Q/321203CJL002-2016）；1、5 mL一次性使用无菌注射器（上海康德莱企业发展集团股份有限公司，医疗器械注册证编号：国械标准20163150518）；75%酒精溶液（山东安捷高科消毒科技有限公司，标准号：Q/371402AAJ008），以上均由南通大学附属医院针灸科提供。木瓜蛋白酶（美国Worthington，活力：200万单位/g）；p38阻断剂SB203580（APEXBIO，Houston，USA；货 号：A8254）；苏 木素、伊红染料（PHYGENE，货号：PH0516）。

1.3 主要仪器手术刀片（华佗牌，生产编号：20010020）；RM2135型石蜡切片机（德国徕卡）；Leica DM4000B型显微镜（德国徕卡）；DW-86L628型-70℃低温冰箱（中国海尔）。

1.4 造模与分组将40只新西兰大耳白兔根据体质量由Excel 2003产生随机数字表，随机分为对照组、模型组、艾灸组、抑制剂组，每组10只。所有兔于相同条件下适应性喂养1周，记录各组兔体质量，观察精神状态、活泼程度、进食量等情况无差别后，在无菌条件下，对模型组、艾灸组、抑制剂组兔采用注射木瓜蛋白酶法造模[2-4]。具体操作：将4 g木瓜蛋白酶用100 mL的生理盐水配成4%的浓度，将实验兔固定于固定器中，屈曲右后肢膝关节，局部碘伏棉签消毒后，自髌韧带外侧进针，将提前配置好的4%木瓜蛋白酶溶液按照0.1 mL/kg注射于右膝关节腔内。造模结束后继续归笼喂养，每日驱赶兔活动30 min，2周后对比观察发现模型组、抑制剂组、艾灸组兔右后肢膝关节出现肿胀、屈伸功能障碍，并评估Lequesne评分，总分＞4分为造模成功。

1.5 实验干预艾灸组：参照《实验针灸学》家兔针灸穴位图及人犊鼻穴、足三里穴，将兔置于固定器中，四肢束缚制动，右后肢简单剃毛后，作穴位定位，艾条点燃施灸于右后肢犊鼻穴、足三里，艾条燃端距离穴位处皮肤2 cm。施灸过程中观察兔的反应，每穴每次15 min，5次/周，连续治疗3周。抑制剂组：制作KOA模型后立即关节腔内注射p38阻断剂SB203580 0.1 mL（100 μmol/L），1次/周，连续治疗3周。模型组：制作KOA模型后，不予治疗，单笼饲养，常规饮食；参照艾灸组与抑制剂组每日固定器固定30 min。对照组：不造模，不治疗，单笼饲养，常规饮食；参照艾灸组与抑制剂组每日固定器固定30 min。

1.6 观察指标

1.6.1 Lequesne评分 治疗前及每周治疗结束后均由同一名不参与实验的课题组成员称质量并评估Lequesne评分，测定其膝关节状态改变与行为学改变。评估内容包括局部疼痛刺激反应、步态改变、关节活动范围、关节肿胀程度4个方面，由同一名不知情的非本实验人员进行评分并记录总分。评分标准见表1。

表1 Lequesne评分标准

治疗前Lequesne评分：造模结束2周后，艾灸、抑制剂干预治疗前即对全部兔进行评分，观察其右后肢膝关节肿胀情况，对局部按压的疼痛反应程度及关节可自由活动的角度，驱赶兔并观察步态情况，评分并记录总分；治疗后Lequesne评分：艾灸、抑制剂干预治疗后次日，由同一观察者重复上述操作。

1.6.2 关节软骨观察 治疗3周后，耳缘静脉注射空气处死各组兔，置于手术台上，使其呈仰卧位，先后伸直并固定其双侧膝关节，使用手术刀将右膝髌骨处皮肤、肌肉、韧带依次切开剥离后，肉眼观察右膝关节腔内关节软骨表面整体情况，拍照并记录其颜色、质地、光滑程度。使用尖刀片切取右膝膝关节表面正中软骨约100 mg软骨标本，用生理盐水洗净后，直接置于体积分数4%的中性甲醛中，固定72 h；将膝股骨远端及胫骨近端连同软骨下骨一并锯下，去除周围软组织，将切除的完整组织标本立即放入4%多聚甲醛液中，固定48 h，置于脱钙液（甲醛10 mL，硝酸20 mL，双蒸水90 mL）中脱钙24 h，并常规脱水、浸蜡、包埋，沿膝关节矢状面切片，脱蜡、透明后行HE染色，显微镜下进行组织学观察。

1.7 统计学方法使用SPSS 19.0统计分析软件进行统计分析，计量资料均采用“均数±标准差”（±s）表示，计量资料均进行正态性检验及方差齐性检验，3组模型兔治疗前后得分比较采用重复测量方差分析；组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组兔Lequesne评分比较造模后，模型组、抑制剂组、艾灸组兔Lequesne评分比较，差异无统计学意义（P=0.916＞0.05），具有可比性。

组间比较：治疗1周、2周、3周后，艾灸组、抑制剂组Lequesne评分均明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；艾灸组与抑制剂组兔Lequesne评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

组内比较：艾灸组、抑制剂组兔治疗1周、2周、3周后Lequesne评分均明显低于治疗前（P＜0.01），模型组兔仅于治疗第3周后Lequesne评分低于治疗前（P＜0.01）。（见表2）

表2 各组兔治疗前后Lequesne评分比较（±s，分）

表2 各组兔治疗前后Lequesne评分比较（±s，分）

注：F时间主效应=330.880，P时间主效应=0.000；F分组主效应=29.096，P分组主效应=0.000；F交互效应=17.183，P交互效应=0.001；与模型组比较，aP＜0.01；与同组治疗前比较，bP＜0.01

组别 动物数（只） 治疗前 治疗1周后 治疗2周后 治疗3周后 F P模型组 10 8.80±0.327 8.40±0.221 7.70±0.271 6.25±0.261b 40.085 0.000抑制剂组10 8.70±0.367 6.45±0.273ab 5.45±0.283ab 3.70±0.186ab 285.000 0.000艾灸组 10 8.90±0.458 6.50±0.298ab 4.85±0.150ab 3.30±0.170ab 116.157 0.000 F 0.088 21.632 43.460 99.845 P 0.916 0.000 0.000 0.000

干预方式与时间存在交互作用，变化趋势相同，治疗后Lequesne评分较治疗前均降低，其中艾灸组与抑制剂组下降趋势较模型组更明显。（见图1）

图1 交互效应轮廓图

2.2 各组兔膝关节软骨观察对照组兔关节解剖后肉眼可见关节局部境界清晰，无肿胀，关节周围肌肉饱满无萎缩，关节间隙未见狭窄，软骨表面光滑，无积液；模型组兔关节解剖后肉眼可见关节局部明显肿胀，关节周围肌肉明显萎缩，关节间隙狭窄，软骨表面粗糙，关节囊肥大增厚，有淡黄色浑浊黏稠分泌物；艾灸组与抑制剂组差距较小，均可见关节局部较对照组轻微肿胀，肿胀程度均明显轻于模型组，关节周围肌肉萎缩不明显，关节囊轻度增生，关节间隙稍变窄，软骨表面尚平滑，少量乳白色分泌物。（见图2）

图2 各组兔膝关节软骨比较

2.3 各组兔膝关节软骨病理学改变对照组切片中髓腔内细胞分布均匀，细胞数量正常；模型组切片中髓腔内可见明显细胞聚集，分布杂乱，大量炎细胞浸润，炎细胞数量明显增多；艾灸组及抑制剂组切片中髓腔内炎细胞聚集程度及数量较模型组明显减少。（见图3）

图3 各组兔膝关节软骨病理学改变（HE，×200）

3 讨 论

膝骨关节炎（KOA）是以关节软骨的退行性改变和继发性骨质增生为特征的疾病，其病理改变以软骨变性、关节增生、骨赘形成为主。随着人年龄的增长，关节软骨变性破坏，加上关节活动过多，关节增生骨赘形成，刺激周围软组织，导致炎症性充血渗出、炎性渗出物压迫，引起不同程度的疼痛、肿胀及关节活动障碍。因此，抑制炎症反应、缓解疼痛、改善膝关节功能活动，对膝骨关节炎的治疗具有重要意义[5]。近年来，对于膝骨关节炎的临床研究大多从炎症反应机制、软骨代谢机制、血液循环机制[6]等方面展开。本研究以艾灸抑制膝关节局部炎症反应，改善膝关节局部血液微循环，减轻膝关节局部疼痛为切入点，观察艾灸“犊鼻”“足三里”对KOA模型兔膝关节软骨病理学及行为学的影响。

p38 MAPK信号通路是MAPKs通路中的重要分支，在疼痛信息传递过程中起到重要作用，与细胞炎症、应激、凋亡的调控密切相关[7]。当p38 MAPK受到炎性因子等外界刺激被激活后发生磷酸化，使机体的痛阈降低，疼痛敏感[8]。而此过程能被p38 MAPK的阻断剂SB203580阻断，特异性的与两种序列非常相近的蛋白质结合并抑制其活性，从而有效地抑制炎症因子。YANG K Y等[9]研究发现注射p38 MAPK抑制剂SB203580能有效缓解痛觉过敏。因此，对于p38 MAPK信号通路的调控与膝骨关节炎病程的发展密切相关。

中医学认为，KOA属“痹证”范畴。“故骨痹不已，复感于邪，内会于肾；筋痹不已，复感于邪，内会于肝”。《素问·上古天真论篇》中记载：“丈夫八岁，肾气实……七八，肝气衰，筋不能动”。膝骨关节炎的发生发展主要是由于年老体弱，筋骨失养，肝肾亏虚，气血不足，复感外邪，风寒湿热侵袭肢体，经络痹阻，日久气血瘀滞，筋脉拘挛，屈伸不利，不通则痛，发为本病[10]。本病以虚为主，虚中夹实。因此，中医治疗应以培本固元，补气活血为主。

由于西药、手术方法临床治疗KOA的局限性，中医药治疗KOA的研究越来越多。艾灸疗法作为中国传统的治疗方法，追古溯今，源远流长。《素问·异法方宜论篇》中记载：“脏寒生满病，其治宜灸焫”[11]。艾灸疗法将艾叶等材料加工制成艾条，燃烧后在体表特定穴位上方温熨，借助灸火的热力和艾叶的药理作用，激发经络气血的运行，起到温经散寒、活血化瘀、通络止痛、扶正祛邪的作用，从而达到防治疾病的目的。相关研究表明[12]，燃烧艾灸产生的热量通过腧穴传入体内，达到疏经通络止痛的作用，从而改善关节活动功能障碍。本课题组前期研究显示[13-14]，艾灸可明显改善膝骨关节炎患者疼痛、僵硬、功能障碍等临床表现，并能改善患者的生存质量，是一种安全、有效的治疗方法。

本研究选取“犊鼻”“足三里”，从腧穴角度看，两穴均归多气多血之足阳明胃经，犊鼻穴位于髌骨外侧下方，髌韧带外侧凹陷中，具有祛风散寒、通利关节的作用；足三里穴位于犊鼻穴下3寸，距胫骨前嵴约一横指，具有活血通经、扶正培元的作用。从解剖角度看，两穴均位于膝周，膝关节局部皮肤薄而松弛，皮下脂肪少，周围有韧带加强关节的稳定，股动脉、腘动脉、胫前动脉等多个分支在其周围吻合形成动脉网，具有丰富的血供。许多研究证实艾灸的温通作用能够降低血液黏稠度和血小板的聚集，增加缺血组织血流量，有效改善血液微循环，促进膝关节动脉网功能的恢复，刺激局部肌肉，维持膝关节结构稳定，还可降低关节滑膜炎症，减轻关节软骨的破坏。李秀彬等[15]通过观察隔附子饼灸对膝骨关节炎患者血液流变学指标的影响，发现艾灸能够改善血液循环，清除自由基，减少炎症刺激。

本实验运用木瓜蛋白酶诱导法建立兔膝骨关节炎模型，结果显示造模后，模型组可见明显细胞聚集，且分布杂乱，大量炎细胞浸润，炎细胞数量明显较多；与模型组比较，艾灸组、抑制剂组炎症细胞聚集现象明显减轻，艾灸组与抑制剂组比较，炎症细胞聚集现象差异不大；通过比较每周治疗后Lequesne评分，我们发现艾灸组、抑制剂组较模型组Lequesne评分明显降低，提示艾灸治疗与抑制剂治疗均能减轻膝关节炎局部肿胀、疼痛，改善关节活动度，这与课题组前期的临床试验结果相吻合[13]；虽然艾灸组与抑制剂组治疗后Lequesne评分比较，差异无统计学意义，但是经过3周的治疗后，艾灸组Lequesne评分差值较抑制剂组更大。我们推测随着治疗时间的延长，艾灸疗效逐步累积，两组的差异会显现出来，这有待于今后进一步的实验研究。

结合组间膝关节软骨病理学的改变与行为学改变可知，艾灸治疗对膝骨关节炎关节软骨有保护作用，能够有效地降低KOA兔膝关节炎症聚集，减轻膝关节局部肿胀、疼痛，改善其活动步态与关节活动度，疗效与p38 MAPK抑制剂SB203580治疗相当。提示p38 MAPK信号通路可能参与了艾灸治疗膝骨关节炎的过程。具体的分子机制有待于进一步的实验研究。