黏附侵袭性大肠杆菌LF82对结肠炎小鼠炎症通路的影响

沙素梅，陈芬荣，涂永久，曾虹，景妍，崔婷，王晶，李路，徐斌

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)，是一种病因不明的慢性非特异性炎症性疾病。虽然遗传和环境因素都被认为参与了IBD的发病，但其潜在的机制仍不清楚，因此IBD仍无法彻底治愈，严重影响患者生活质量和生命健康[1]。多项研究表明肠道某些病原微生物可能参与其发生发展，前期应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、原位杂交、测序等方法已证实IBD患者存在肠道微生态失调，主要表现为生物多样性降低、有益菌减少和有害菌增多[2-3]。近年来，有研究者发现大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)中的特殊类型，即黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasiveEscherichiacoli，AIEC)，这一类细菌虽然不含经典致病性E.coli的致病因子，但具有黏附于肠上皮细胞并在细胞内复制，同时具有侵袭真核细胞的特性，因此被单独归类并命名[4-5]。来自欧洲和北美的研究表明，在炎症活动的IBD患者肠黏膜中AIEC数量明显增加[6-7]，且回肠中AIEC数量显著多于结肠[8-9]。总的来说，成人CD患者肠黏膜中AIEC的发现率为21%～63%，而在活动期和静止期UC患者粪便样本中分别发现了35%和27%具有黏附侵袭性的大肠杆菌菌株(与对照组的5%相比，P<0.05)[10-11]。最受关注的AIEC菌株E.coliLF82最早由来自法国的Arlette Darfeuille-Michaud研究组从一名CD患者的回肠标本分离鉴定。

自从20年前发现AIEC以来，在揭示这些细菌的特性及其与肠道免疫系统的相互作用方面取得了一些进展，如发现E.coliLF82可破坏体外肠上皮模型的屏障完整性及通透性，增加炎症因子的释放[11-12]。研究还揭示了E.coliLF82含有多种毒力因子，如鞭毛、1型菌毛、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)等。这些毒力因子赋予了AIEC黏附、侵入、存活和在宿主细胞内复制的能力，并通过触发一系列信号通路导致严重的屏障功能障碍和促炎反应，最终促使IBD发生[13]。然而，由于这些相关研究大多来源于体外实验，因此了解其在宿主体内及体内组分之间的相互作用至关重要。本课题组前期研究发现E.coliLF82菌株可加重葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)小鼠的肠道炎症，并破坏结肠结构和功能[14]。为了明确其中可能的机制，本研究拟在前期工作的基础上，在这些动物模型中比较E.coliLF82菌株对实验性结肠炎小鼠血清及结肠组织中炎症因子的变化，并初步探讨炎症通路相关分子的改变，以期为将来探讨肠道微生物在IBD中的发病机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和动物

DSS来自Appli Chem GmbH公司，Luminex细胞因子检测试剂盒来自Millipore公司，引物合成由宝生物工程(大连)有限公司完成，兔抗小鼠P65抗体来自Santa公司，兔抗小鼠磷酸化P65抗体来自Immunoway公司，兔抗小鼠P38抗体来自Santa公司，兔抗小鼠磷酸化P38抗体来自Bioworld公司，实时荧光定量PCR仪来自罗氏公司，化学发光凝胶成像系统来自Bio-Rad公司，清洁级C57BL/6小鼠来自空军军医大学实验动物中心，AIEC菌株E.coliLF82由Arlette Darfeuille-Michaud教授馈赠。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养、结肠炎模型建立和样本留取 在含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB培养基中挑取E.coliLF82菌株单克隆，37 ℃振荡培养箱过夜，连续梯度稀释后于分光光度计以OD600=1为1×109/mL测定浓度，计算所需菌液的量。选取6～8周龄、体质量20～25 g的C57BL/6J小鼠24只，将其随机分为DSS组、DSS+LF82组和健康对照组，每组8只。使用DSS造模前一周连续予DSS组小鼠蒸馏水灌胃，DSS+LF82组小鼠予E.coliLF82菌株(1×109/CFU/只)灌胃，健康对照组不做处理，并于DSS造模当天停止灌胃。后予DSS组和DSS+LF82组小鼠自由饮用含4%DSS的水，健康对照组自由饮用纯净水。每日观察各组小鼠的一般情况、大便性状、血便及体质量变化，一周后处死小鼠并留取血液和结肠组织标本。将血液于室温下静置至完全凝固后以1 000×g离心10 min，吸出上层血清分装并于-20 ℃冰箱保存(用于ELISA检测细胞因子)。部分结肠组织存于液氮备用(用于PCR检测细胞因子的mRNA水平)，部分经10%甲醛固定用于石蜡包埋(用于Western blot检测蛋白表达)。

1.2.2 测定小鼠血清中炎症因子的分泌 采用Bio-plex检测平台高通量测定各组小鼠血清中的炎症因子，本研究中选取的炎症因子包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin，IL-10)、IL-17A、IL-1β、IL-6、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)。具体步骤：取出血清样品，完全溶解并旋涡混匀后使用Assay Buffer以1∶1比例稀释、准备抗体固定微球、准备质控对照、Wash Buffer和Serum Matrix、制备标准品并梯度稀释、免疫测定，最后根据标准曲线计算各实验组血清中的细胞因子量。

1.2.3 测定小鼠结肠组织中炎症因子的mRNA水平 提取结肠组织总RNA并反转录，设计合成引物并进行blast分析，通过real-time PCR测定各炎症因子的mRNA水平。PCR反应为20 μL体系，包括：上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，2×SYBR® Premix Ex TaqTM10 μL， dd H2O 7 μL，同时设置阴性、阳性和空白对照。以GAPDH为内参，应用2-ΔCt法计算各炎症因子在不同组小鼠中的差异，ΔCt=Ct目的基因-Ct GAPDH。引物的序列、退火温度(Tm值)及产物大小具体见表1。PCR反应的条件为：94 ℃ 30 s, 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 37 ℃ 300 s，其中重复步骤2～4(45个循环)。

表1 引物序列、PCR退火温度及产物大小

1.2.4 NF-κB P65和P38蛋白水平的检测 分别提取各组小鼠的结肠组织总蛋白，定量后应用Western blot测定各蛋白的表达水平。分别配制10%及12%的聚丙烯酰胺凝胶、下层分离胶及5%的上层积层胶，组装电泳装置，加入电泳液及待测蛋白，恒流25 mA电泳，半干法20 V转膜30 min，立春红染膜并封闭后加入适量稀释的一抗(P65、磷酸化P65、P38和磷酸化P38的稀释浓度分别为1∶200， 1∶500， 1∶200和1∶500)。置于4 ℃冰箱过夜，次日取出复温，冲洗后以一定浓度的二抗在常温下孵育1 h，后加入ECL底物显影液，于化学发光成像系统采集信号并分析结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 定植E. coli LF82可刺激结肠炎小鼠炎症因子分泌

检测各组小鼠血清的炎症因子分泌水平，结果发现DSS组和定植E.coliLF82的DSS+LF82组小鼠血清中各炎症因子均较正常对照组明显增加，且定植E.coliLF82的DSS+LF82组细胞因子升高水平更明显，其中TNF-α、IL-10、IL-17A和IL-1β和IFN-γ的水平在DSS组和DSS+LF82组间差异有统计学意义，见图1。

图1 健康对照组、DSS组和定植E. coli LF82的DSS+LF82组小鼠血清中炎症因子水平(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 定植E. coli LF82可增加结肠组织的炎症因子表达

应用real-time PCR检测了各组小鼠结肠组织炎症因子的mRNA表达变化，扩增曲线及溶解曲线提示无引物二聚体形成，PCR产物特异性高。结果发现，炎症因子的mRNA表达与血清中变化趋势一致，DSS组和DSS+LF82组均显著高于健康对照组，且这些变化在经E.coliLF82处理的DSS+LF82组更明显。除IFN-γ外，组间的差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 健康对照组、DSS组和定植E. coli LF82的DSS+LF82组小鼠组织中的炎症因子mRNA水平(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 定植E. coli LF82可上调结肠炎小鼠结肠中炎症通路蛋白的表达

为了研究E.coliLF82加重DSS小鼠肠道炎症的机制，我们还通过Western blot检测了炎症信号通路上的经典蛋白NF-κB P65和P38的表达，结果发现定植E.coliLF82菌株可上调结肠磷酸化NF-κB P65及P38的表达(图3)，AIEC可能通过NF-κB及MAPK信号通路发挥加重肠道炎症的作用。

图3 健康对照组、DSS组和定植E. coli LF82的DSS+LF82组结肠组织炎症通路蛋白的表达情况

3 讨论

虽然未找到明确的IBD致病菌，但已有多项研究表明某些病原微生物和功能改变的共生菌可能参与其中，其中大肠杆菌中的特殊类型—AIEC在IBD中的可能致病作用引起了研究者的注意。AIEC的表型包括：①黏附到肠上皮细胞的能力；②通过参与宿主细胞肌动蛋白的聚合和微管招募侵袭IEC；③不诱导细胞死亡，并在巨噬细胞内存活和复制；④没有任何已知的特定的侵袭决定簇[8]。来自西方国家的研究发现，CD[7]和UC[6]患者炎症活动的肠黏膜中AIEC数量均明显高于缓解期患者及健康志愿者。最近有系统综述[15]分析了IBD患者中的AIEC流行率，结果发现与非IBD对照组相比，CD患者中AIEC阳性的OR值为3.27(95%可信区间为1.79～5.90)，CD患者AIEC的总体合并阳性率为29%(95%可信区间0.17～0.45)，而对照组阳性率为9%(95%可信区间为0.03～0.19)。UC患者的AIEC阳性率为12%(95%可信区间为0.01～0.34)，而对照组阳性率为5%(95%可信区间0.0～0.17)。与对照组相比，UC患者AIEC阳性的OR为2.82(95%可信区间为1.11～7.14)，以上研究表明AIEC可能与CD和UC的发病均相关。

自从首次提出AIEC的概念以来，科学家们对其全基因组进行了分析，也有大量关于AIEC菌株E.coliLF82的研究报道，逐渐揭示了AIEC的生物学特征及其与宿主免疫系统之间的相互作用，阐明了AIEC黏附、侵袭和易位至固有层的相关机制[16-17]。如鞭毛蛋白和OmpC作为细菌黏附抗原诱导CD，在AIEC毒力中发挥重要作用[18-19]。1型菌毛可介导AIEC与肠上皮细胞的黏附。OmpC也可能影响鞭毛和1型菌毛的表达[20]。虽然体外实验[21]已证实E.coliLF82菌株能刺激肠黏膜屏障模型产生TNF-α和IL-8等细胞因子，本课题组前期研究也发现E.coliLF82菌株可加重DSS小鼠的肠道炎症，并破坏结肠结构和功能。但其在体内尤其是UC中的作用机制并不完全清楚。因此，本研究在前期的基础上，比较了E.coliLF82菌株对实验性结肠炎小鼠血清及结肠组织中炎症因子的变化，并初步探讨了其中可能的机制。

小鼠DSS结肠炎模型可诱导上皮损伤，具有快速、简单、可重复性和可控性高等优点，是研究UC较理想的动物模型[22]。因此，与其他经典造模方法一样，本研究选取了DSS进行造模，并于造模后一周处死小鼠进行各指标的观察。一方面通过高通量的方法检测实验动物血清中的炎症因子分泌，另一方面测定结肠组织中它们的mRNA表达水平，结果发现定植E.coliLF82可刺激结肠炎小鼠炎症因子的分泌和表达，进而使机体出现更严重的炎症反应，研究结果与实胞试验一致[23]。我们知道，TNF-α是IBD的一个关键细胞因子，患者肠黏膜中往往存在TNF-α的高水平表达，并且与疾病临床严重程度呈正相关[24]，TNF-α还能促进AIEC在巨噬细胞内的复制[25-26]。我们的研究同样发现E.coliLF82可促进结肠炎小鼠血清和肠黏膜组织TNF-α的释放。推测AIEC诱导高水平TNF-α的释放，反过来又可促进AIEC在炎症和感染通路中的复制，从而导致IBD的肠道炎症和上皮细胞损伤。除了传统认为的Th2和Th1细胞介导的异常免疫反应介导了UC和CD的发病以外，近年来Th17细胞的发现及其在CD和UC中重要致病作用的阐明是IBD领域的重大发现。该理论认为：被IL-23刺激后，原始 CD4+T 细胞可发育成为Th17细胞，并与其表面的IL-23R结合，从而激活下游的STAT3、NF-κB等转录因子，促使炎症发生。在本研究中，我们也发现了与Th17细胞分泌相关的主要炎症因子IL-6、IL-17A等明显增加，表明AIEC菌株E.coliLF82可能通过IL-23/IL-17免疫通路引起慢性炎症反应和组织损伤，从而促进肠道炎症的发生。此外，我们的结果还发现定植E.coliLF82菌株可上调DSS结肠炎小鼠组织中磷酸化NF-κB P65和P38的表达，根据以上结果推测E.coliLF82菌株加重小鼠结肠炎症可能是通过激活NF-κB和MAPK信号通路来实现。

但值得注意的是，AIEC在IBD中确切的作用仍不完全清楚，尤其是在UC的进展过程中，AIEC究竟起病因作用还是疾病的结果尚未完全阐明。一方面，除了前期已证实的AIEC可破坏宿主黏膜免疫、屏障完整性及诱导炎症因子产生以外，近期的研究也证实了AIEC感染本身可导致肠道微生态的改变[27]，而CD患者的无炎症黏膜中AIEC的存在表明大肠杆菌的侵袭性可能不依赖于黏膜屏障的炎症和破坏而存在[10]。这些结果表明大肠杆菌侵袭黏膜可能是一种早期致病事件，说明AIEC的过度生长可能是炎症反应的直接原因。另一方面，动物实验发现抗生素、高脂/高盐饮食[7, 28]导致的肠道微生态失调及肠道炎症可增加AIEC的定植，进一步导致结肠炎症的加重，说明AIEC的过度生长可能是炎症反应的结果。再者，健康个体中AIEC菌株的发现率分别为结肠标本0%到16%，回肠标本6%到19%，提示这些细菌需要与IBD的其他相关危险因素联合作用下才能发挥致炎作用，如宿主的遗传易感性和环境刺激等[25]。综上所述，AIEC能直接或间接损害肠上皮屏障并激活炎症反应，但是确切的机制还需要进一步的研究。