基于高通量测序探究芒硝用于肠道准备对菌群的影响

戴鹏辉，夏洪芬，唐凤，甘轲，朱娅,邓明明

结肠镜检查是结直肠病变筛检的重要方法，而良好的肠道准备不仅可以提高肿瘤及息肉的检出率，同时还可以缩短检查时间、减少相关并发症[1]。目前，临床上可用于肠道准备的药物众多，其中以聚乙二醇最为广泛[2]。但聚乙二醇口感不佳、容量负荷大，且恶心、呕吐、腹痛等不良反应发生频率高[1]，约有5%～15%的患者无法完成肠道准备[3]。近年来越来越多的研究表明，聚乙二醇在肠道准备过程中会对人体的肠道微生态产生较大影响[2,4]，这种影响在IBS、IBD等已经存在菌群紊乱的患者中将会持续更长的时间[5]。肠道微生态与宿主的健康密切相关，肠道菌群对于调节宿主的消化吸收、物质代谢、免疫防御等生理功能起到重要作用，还与宿主的骨骼、肌肉、大脑的发育相关[6]；稳态的失衡与多种疾病的发生发展密切相关，如结直肠肿瘤、炎症性肠病、肠易激综合征、糖尿病等[7]。

芒硝是我国传统医药，主要成分为Na2SO4·10H2O，具有泻下、抗炎的药理作用[8]，用于肠道准备已有20多年历史。芒硝在肠道清洁方面优于聚乙二醇，表现为更少的肠道残余粪水量及泡沫量，且不良反应少、耐受性高[9-10]。鉴于目前尚缺乏关于芒硝用于肠道准备对菌群影响的相关研究，本试验采用前瞻性研究方法进一步探究芒硝对菌群影响，为其临床应用提供更加有力的理论支撑。

1 资料与方法

1.1 研究对象

共招募西南医科大学健康受试者10名，其中女生7名、男生3名。10名研究对象平均年龄(21.30±1.06)岁,平均身高(166.40±5.64) cm,平均体重(56.00±5.50) kg,平均BMI (20.32±1.68) kg/m2。试验期间，所有受试者均未发生感染、未服用抗菌药物；所有受试者均被要求规律作息、清淡饮食，禁止食用添加有益生菌成分的药物或食物。本试验经由西南医科大学附属医院伦理委员会审批通过(受理号：KY2021073)。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①年龄18～65岁、体重指数介于18～28 kg/m2的无基础疾病者；②无肠道准备禁忌症；③1个月内未食用含有益生菌的药物或食物；④3个月内无其他临床试验；⑤近1个月未进行肠道准备；⑥签署了知情同意书。 排除标准：①吸烟、酗酒、药物滥用、生活作息不规律者；②1个月内使用过胃肠动力药物；③3个月内使用过抗生素；④阑尾切除者；⑤妊娠、哺乳期女性。

1.3 试验药物

三苏牌芒硝，每袋6 g，每盒9袋，四川省川眉芒硝有限责任公司(批准文号：国药准字Z51022578)。

1.4 给药剂量及方法

肠道准备前一天，所有研究对象建议食用米饭、馒头、面条及其他低纤维食物。肠道准备当天，将试验药物芒硝54 g(共9袋)溶解于400 mL温开水中，顿服，然后在0.5～1 小时内饮入2 000 mL温开水，直至解出无渣清水样便。

1.5 粪便样本收集及DNA提取

共收集三个时间段的粪便标本，即肠道准备前一天成型便、服用芒硝肠道准备后的第一次成型便以及肠道准备后第14天的成型便。将收集到的30份标本按姓名拼音首字母加时间段标号，所有标本立即放入实验室-80 ℃冰箱进行冷藏备用。 使用E.Z.N.A.® soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)试剂盒进行微生物DNA抽提，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，使用NanoDrop2000检测DNA浓度和纯度。

1.6 16SrRNA测序及数据处理

基于Illumina Miseq测序平台对经过通用引物338F 5′-ACTCCTACGGGAGG-CAGCAG-3′与806R 5′-GGACTACHV-GGGTWTCTAAT-3′PCR扩增后的16SrRNAV3～V4片段进行高通量测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。使用Fastp软件筛除尾部质量值20以下的碱基，去除50 bp窗口内平均质量值低于20的窗口以及尾端，并使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE软件，按照97%的相似度对序列进行OTU聚类，利用RDP Classifier对OTUs进行物种注释分析,并进行微生物多样性分析，包括α多样性、β多样性。此外,根据分类学层次门和属分析微生物的群落结构以及物种丰度。

1.7 16SrRNA绝对定量分析

提取粪便样本中细菌总DNA，选择16SrRNA作为扩增区设计引物，引物序列：上游5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR扩增条件;预变性 95 ℃ 3 min，95 ℃ 变性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环。应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品及待测样本进行分析，建立绝对定量的标准曲线从而对样本中的细菌进行定量，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 肠道菌群多样性分析

2.1.1 α多样性分析 肠道菌群α多样性基于样本的OTU种类及丰度进行计算，具体结果见表1。其中Coverage指数表示的是样本的测序深度，代表样本的覆盖率。从表1可以得知，三组样本的Coverage均在99.8%以上，说明此次测序得到的微生物物种能够覆盖样本中绝大多数的物种,与三组样本Shannon指数稀释曲线的结果一致，见图1。Chao指数反映环境中物种的丰度,并与之成正相关，即数值越大物种丰富度越高。如表1所示，肠道准备前的Chao指数为248.20±51.43，肠道准备后为262.60±66.48，肠道准备14 d为276.40±41.21，说明服用芒硝后物种丰富度有少许增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。Shannon及Simpson指数可用来反映样本中物种的多样性，包括丰度及均匀度。如表1所示，肠道准备前、准备后及14 d的Shannon指数分别为3.12±0.38、3.18±0.34、3.22±0.36，差异无统计学意义(P>0.05)；Simpson指数分别为0.08(0.06,0.14)、0.08(0.07,0.12)、0.07(0.06,0.11)，差异无统计学意义(P>0.05)，说明服用芒硝后宿主肠道菌群多样性基本未发生变化。

图1 三个时间段Shannon指数稀释曲线

表1 三个时间段Shannon、Simpson、Chao、Coverage指数

2.1.2 β多样性分析 肠道菌群β多样性可用来反映不同样本间群落结构的差异或相似程度。如图2所示，基于unweighted UniFrac多样性距离进行Adonis分析，肠道准备前、准备后及14 d的β多样性并无统计学差异(P>0.05)，说明服用芒硝后肠道菌群的组成成分并未发生显著改变，菌群结构相似。

图2 三个时间段肠道菌群β多样性分析(P=0.891)

2.2 肠道菌群定量分析

如图3所示，荧光定量PCR显示,肠道准备前、准备后及14 d的菌群总量相近，差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 三个时间段肠道菌群定量分析(P=0.601)

2.3 肠道菌群组成结构分析

2.3.1 肠道菌群在门水平结构上的分析 如图4所示，三组样本的菌群结构在门水平上分析，均以厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)及拟杆菌门(Bacteroidetes)为主。如表2所示，与肠道准备前比较，厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门在肠道准备后丰度稍有变化，但均无统计学差异(P>0.05)。与肠道准备前比较，肠道准备后拟杆菌门丰度稍有增多，而厚壁菌门、放线菌门及变形菌门的丰度略有减少，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidota在三个时间段中比例

图4 三个时间段门水平菌群成分组成

2.3.2 肠道菌群在属水平结构上的分析 如图5所示，三组样本的菌群结构在属水平上(丰度>0.05%)分析，top10优势菌为布劳特菌属(Blautia)、霍氏真杆菌属(Eubacterium-hallii-group)、志贺氏埃希菌属(Escherichia-Shigella)、栖粪杆菌属 (Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、链球菌属(Streptococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus-torques)及长奈瑟氏菌属(Dorea)。如表3所示，与肠道准备前比较，肠道准备后梭菌属明显减少而内脏拟杆菌属显著增多，差异均具有统计学意义(P<0.05)；肠道准备14 d基本恢复至基线水平，差异无统计学意义(P>0.05)。与肠道准备前比较，肠道准备后及肠道准备14 d链球菌属、拟杆菌属虽有少许变化，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 Clostridium、Odoribacter、Streptococcus、Bacteroides在三个时间段中比例

图5 三个时间段属水平菌群成分组成

3 讨论

肠镜检查是目前诊断结直肠疾病的首选检查。通过清晰的图像传送可清楚识别肠黏膜各种病变，必要时可进行活检及各种镜下治疗，而良好的肠道准备是重要前提。目前复方聚乙二醇电解质散(PEG)仍为国际国内指南推荐的一线肠道准备用药，4 L PEG的单次剂量方案与分次剂量方案在肠道准备的有效性、安全性、耐受性方面相当[11]，但两种给药方案均会对肠道微生态造成破坏[4]，尤其是用于幼儿、老年人以及存在菌群紊乱(炎症性肠病、肠易激综合征等)的特殊患者，甚至可能会加重后者肠道不适的症状[5]。越来越多的证据表明，肠道菌群及其代谢产物对维持人体健康至关重要，菌群丰度及多样性的改变与众多疾病的发生发展密切相关。然而，不同的肠道准备药物可能导致不同的菌群变化[12]。国内肠道准备药物芒硝是一种天然矿物盐，服用后大量硫酸根离子会积聚于肠道而形成肠腔高渗状态，肠腔水分的增加刺激肠道蠕动加快从而达到导泻效果[9]。

人体肠道微生态系统主要以专性厌氧菌(如厚壁菌门、拟杆菌门)为主，兼性厌氧菌(如变形菌门)只占了很少的比例[13]。研究表明，聚乙二醇进行肠道准备会对菌群产生较大干扰[2,4,12,14-15]，与大剂量聚乙二醇溶液冲刷肠壁附着的菌群、肠道准备过程中空气的进入破坏菌群赖以生存的厌氧环境以及聚乙二醇的化学性刺激导致肠道蠕动加快等因素有关[2,4,12]。菌群丰度方面表现为门水平上厚壁菌、拟杆菌丰度的降低，变形菌丰度的增高[2,12,15]；属水平上乳杆菌、梭菌、瘤胃球菌丰度的降低，嗜血杆菌、长奈瑟氏菌丰度的增高[4,12]。菌群多样性方面表现为α多样性、β多样性均发生显著变化[2,14]，但也有研究证实菌群多样性未发生显著改变[15-16]。与既往研究不一致的是，在本研究中我们发现芒硝用于肠道准备对菌群影响并不明显。首先是菌群多样性方面，芒硝肠道准备后的菌群α多样性、β多样性均未发生明显变化，即使肠道准备后14 d较前仍无较大变化。其次是菌群丰度方面，门水平上厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门丰度均未发生显著变化，即使肠道准备后14 d仍与基线水平持平。厚壁菌门的普氏栖粪杆菌、拟杆菌门的多形拟杆菌能够增加短链脂肪酸的合成，起到保护肠黏膜上皮屏障功能以及降低全身炎症反应的作用，被认为是抗炎症细菌[5,17-18]。除此以外，厚壁菌与拟杆菌比例与个体远期健康状况密切相关[19]，二者比例的失衡将会带来潜在的疾病风险,本研究中芒硝并未引起该比例失调，说明芒硝用于肠道准备对个体长期影响也比较小。属水平上(丰度>0.05%)，仅梭菌属、内脏拟杆菌属丰度变化最为明显，但14 d后基本恢复至基线水平。梭菌是一种革兰阳性芽孢杆菌，为重要的条件致病菌，其中肠道艰难梭菌感染常常发生在菌群严重失调的人群，甚至进展为致死性的伪膜性肠炎[20]。内脏拟杆菌为肠道内产短链脂肪酸的常见菌，其丰度的降低与非酒精性脂肪性肝病、囊性纤维化、炎症性肠病相关[21]。而与聚乙二醇不同的是，链球菌属、拟杆菌属丰度无明显变化。链球菌除了能够导致大叶性肺炎、感染性心内膜炎以及化脓性炎症[22]外，还会破坏肠黏膜屏障功能，引起肠漏综合征[23]。拟杆菌有助于肠道内厌氧菌的生长，是人体重要的益生菌[24]，可长期维持人体健康，双歧杆菌已作为益生菌补充剂广泛应用于疾病治疗及预防保健[25]。最后在在菌群总量方面， Jonna等[4]研究发现，聚乙二醇肠道准备后菌群数量锐减，直至肠道准备后14 d基本恢复正常。但本研究中我们并未发现芒硝对菌群量的影响，芒硝肠道准备后菌群总量变化不明显，仍与基线持平。我们推测芒硝之所以对菌群丰度及多样性影响较小可能与芒硝容量负荷小、作用温和有关[26]，减少了对定值于肠腔内的细菌的冲刷、降低了肠道蠕动的频率及幅度，从而减少了对肠道微生态平衡的破坏；同时芒硝具有抗炎、改善胃肠道功能的作用[27]，这也与服用芒硝过程中腹痛、腹胀、恶心、呕吐等不良反应发生率低相契合[10]。至此我们可以得出以下结论，芒硝用于肠道准备对菌群丰度及多样性影响不大。

本研究有以下几个局限性：本研究的研究对象为健康人群，需进一步探讨对处于不同健康状态、不同疾病分期人群的影响；本研究只是初步探讨了芒硝用于肠道准备对菌群影响，并未就菌群代谢产物及影响机制做进一步研究。

综上所述，芒硝用于结肠镜检查前的肠道清洁对菌群影响较小。