淋球菌耐药监测结果分析

梁艳华 曹文苓 黎小东 梁景耀 李华平 杨日东 毕超广州市皮肤病防治所检验科 50095；广州市皮肤病防治所性病科 50095

淋病是常见的性传播疾病，其发病率居高不下，2017—2019年居我国乙类传染病的发病率第4位［1-2］。淋球菌是引起淋病的病原体，目前，淋球菌对多种抗生素产生不同程度耐药，耐药性日趋严重［3］，而且因时间和地区的变化而有所不同，因此世界各地建立了淋球菌耐药监测网络，旨在掌握其耐药机制，研究对策。

我们根据国家疾病预防控制中心（CDC）性病控制中心的淋球菌耐药监测方案，监测淋球菌对7种抗生素的耐药情况，包括产青霉素酶淋球菌（penicillinase producing Neisseria gonorrhoeae，PPNG）相质粒介导的高度耐四环素淋球 菌（highly tetracycline resistant Neisseria gonorrhoeae，TRNG）的流行情况，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 淋球菌 100株淋球菌全部来自2019年12月至2020年11月广州市皮肤病防治所性病门诊患者的泌尿生殖道分泌物；患者全部为男性，年龄17～61岁。所有淋球菌经过革兰染色、氧化酶试验和糖发酵试验确认鉴定［4］，传代一次后洗于脱脂牛奶中，于-80℃低温冰箱冻存备用。

1.1.2 抗生素 青霉素（R082HO，USP）、四环素（R039WO，USP）、环 丙 沙 星（10L049，USP）、大 观霉素（HOM399，USP）、头孢曲松（R07420，USP）、头孢克肟（R095XO，USP）、阿奇霉素（R043PO，USP）均由中国CDC性病控制中心提供。

1.1.3 培养基 淋球菌基础培养基（英国OXOID公司生产，LOT1784808）加入10%脱纤维新鲜羊血。

1.1.4 标准菌株 世界卫生组织（World Health Organization，WHO）标准淋球菌菌株D、G、J、L、P由中国CDC性病控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 将淋球菌菌株和标准菌株用T-M平板培养16～20 h，取菌苔［5］，用生理盐水制成1×107CFU/ml菌悬液。

1.2.2 最 低 抑 菌 浓 度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定 采用WHO西太区淋球菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法［4］，先将7种抗菌药物按要求配成原液，再倍比稀释成不同的浓度，青霉素0.008～32.000 mg/L，环丙沙星0.008～32.000 mg/L，四环素0.25～16.00 mg/L，大观霉素1～128 mg/L，头孢曲松和头孢克肟0.002～1.000 mg/L，阿奇霉素0.016～8.000 mg/L。将3.70%淋球菌基础琼脂高压灭菌，水浴冷却至50℃，加入脱纤维新鲜羊血（终浓度10%）。取0.2 ml倍比稀释好的7种抗菌药物工作液，加入20 ml淋球菌血液基础培养基，混匀后倾倒平板。从低浓度至高浓度配制各种浓度的平板。用多头接种器将实验菌株和标准菌株菌悬液接种于各神浓度的平板，置36℃、5%CO2环境下培养24 h后观察结果，记录无菌落生长的浓度MIC。以WHO的D、G、J、L、P标准菌株作质控。药物敏感性判断标准采用WHO西太区淋球菌耐药监测规划推荐的标准［6-7］：青霉素MIC≤0.06 mg/L为敏感，MIC 0.12～0.10 mg/L为低敏，MIC≥1 mg/L为耐药；环丙沙星MIC≤0.06 mg/L为敏感，MIC 0.12～0.50 mg/L为低敏，MIC≥1 mg/L为耐药；四环素MIC≥1 mg/L为耐药，MIC≥16 mg/L为TRNG；头孢曲松和头孢克肟MIC＜0.25 mg/L为敏感，MIC≥0.25 mg/L为低敏；大观霉素MIC≤32 mg/L为敏感，MIC＝64 mg/L为低敏，MIC≥128 mg/L为耐药；阿奇霉素MIC≤0.25 mg/L为敏感，MIC＝0.5 mg/L为低敏，MIC≥1 mg/L为耐药。

1.2.3 β-内酰胺酶测定 采用纸片碘量法测定菌株是否产β-内酰胺酶，具体操作如下：在试中加入100μl青霉素溶液（10 000 U/ml）、100μl淀粉溶液（1%）、50μl碘试剂，呈蓝色混合物在一滤纸条上滴50μl试剂，将一接种环培养物涂在蓝点上，放置1～2 min，如蓝色变成无色即为β-内酰胺酶阳性，颜色无变化则为阴性。每次试验以WHOJ株作阳性对照，D株作阴性对照。β-内酰胺酶阳性为PPNG。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0进行统计学分析，PPNG和TRNG检出率、各地同一药物的耐药率、低敏率等计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 淋球菌对各监测药物MIC结果 详见表1。

表1 100株淋球菌对7种抗生素耐药结果分布（株）

2.2 淋球菌对7种抗生素耐药结果 详见表2。

表2 100株淋球菌对7种抗生素耐药结果统计（株）

2.3 PPNG和TRNG结果 100株淋球菌中检出PPNG 46株，阳性率为46%（46/100）；检出TRNG 35株，阳性率为35%（35/100）。

2.4 多重耐药情况 100株淋球菌中检出多重耐药菌株80株：对环丙沙星、青霉素、四环素3种抗生素都耐药的64株（64%），对环丙沙星、四环素、阿奇霉素耐药的3株（3%），对环丙沙星、青霉素、四环素、阿奇霉素耐药的13株（13%）。全部菌株对环丙沙星、四环素耐药。

3 讨 论

本次研究显示，淋球菌对青霉素、环丙沙星、四环素、阿奇霉素耐药率远超过WHO规定的5%，提示这4种药物不能作为治疗淋病的首选药。

青霉素耐药率95%，高于广州市2019年的耐药率93%［7］，但差异无统计学意义（χ2＝0.355，P＝0.552），与2008—2014年广州市耐药率（87%）［8］相比，耐药率上升，差异有统计学意义（χ2＝5.249，P＝0.022），与其他地区数据相比，高于广西省［8］（86.81%）（χ2＝3.938，P＝0.047）、江苏省（78.98%）［9］（χ2＝12.442，P＝0.000）。可见广州市淋球菌对青霉素持续高度耐药，有逐步上升趋势，值得我们继续关注。PPNG检出率46%，和广州市之前数据相比，并未增长（2019年广州市PPNG 35%，χ2＝2.510，P＝0.113；2008—2014年广州市PPNG 36%，χ2＝3.660，P＝0.054）。TRNG检出率35%，与广州市2019年的检出率32%、2008—2014年检出率43%相比，差异均无统计学意义（χ2＝0.202，P＝0.653；χ2＝2.254，P＝0.133），说明广州PPNG和TRNG流行率显平稳态势。

2020年度环丙沙星耐药率最高，达到97%，与广西省（98.90%）［9］、江苏省（99.36%）［10］报道一致，且80株多重耐药菌株全部对环丙沙星耐药。

阿奇霉素是WHO、美国疾病预防控制中心及欧洲的治疗指南中推荐与头孢曲松联用治疗淋病的药物［11］。我国淋球菌耐药监测的资料显示，2013—2016年我国淋球菌分离株对阿奇霉素耐药的比例达18.6%［11］，阿奇霉素不宜作为一线推荐药物。本次试验阿奇霉素耐药率为16%，与我国报道接近。这说明淋球菌的耐药性在不同的地区各不相同，淋病的治疗方案要根据各地区的耐药情况制定。

头孢曲松、头孢克肟和大观霉素都未见耐药菌株，头孢曲松、头孢克肟低敏率分别为4%、11%，与2019年的头孢曲松、头孢克肟低敏率（4%、19%）相比，差异均无统计学意义（χ2＝0.000，P＝1.000；χ2＝2.510，P＝0.113）。

淋病患病率男性、女性差别大，大约5∶1［1］。本次研究的淋球菌耐药株全部来自男性患者，有可能女性症状不明显被漏诊，应引起临床医生重视，对女性患者应做淋球菌培养或者核酸检测。

综上所述，淋球菌对大观霉素的敏感性最高，其次是头孢曲松和头孢克肟，这3种药物仍是治疗淋病的首选药，但在其他地区对头孢菌素、大观霉素耐药均有报道，因此耐药监测需持续进行。青霉素、环丙沙星、四环素、阿奇霉素耐药率高且出现多重耐药，已不能作为一线药物治疗淋病，但是其耐药机制传播情况仍是监测重点。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。