miR-3679-5p通过抑制FOXM 1表达对食管癌KYSE30细胞增殖和凋亡的影响

雷蕾 何小俊 李薇薇 王宝英 郑安锐 黄耿鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）消化内科 45000；武汉大学湖北省人民医院，武汉 40060；鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科 45000

食管癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤，呈明显的地域性分布［1］。食管癌早期的症状如异物感容易被患者忽略，进展为晚期后多数患者失去手术机会，5年生存率不到20%［2］。因此，探究食管癌发生和发展的分子机制具有重要临床意义。研究显示，在细胞内存在众多微小RNA（miRNA），miRNA通过抑制或者直接降解靶基因信使RNA（mRNA）表达，影响靶基因的表达，调节细胞的分化、发育、增殖及凋亡等细胞活动［3-5］。miRNA的异常表达与食管癌细胞的放疗敏感性、细胞活力密切相关［6］。研究证实，miR-3679-5p在结直肠癌细胞中发挥抑癌基因作用［7］。关于miR-3679-5p在食管癌细胞中的作用研究尚未见报道。本研究旨在探讨miR-3679-5p对食管癌细胞增殖和凋亡中的影响及可能的分子机制。

1 资料与方法

1.1 材料和试剂 食管癌细胞KYSE30购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；阴性对照模拟物和miR-3679-5p模拟物均由北京天根生化科技有限公司设计并合成；荧光实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒和引物购自大连宝生物工程有限公司；Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂盒和双染流式细胞术试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；一抗CDK1、Bcl-2、Bcl-w、β-actin、叉头框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）购自美国BD公司。

1.2 细胞培养和转染 在37℃、5%CO2条件下，KYSE30细胞采用含10%FBS的RPMI-1640培养基培养。选取对数生长期KYSE30细胞接种于24孔板，待细胞汇合50%时，根据Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂说明书，将阴性对照模拟物和miR-3679-5p模拟物转染KYSE30细胞，培养8 h后更换培养基。

1.3 RT-qPCR检测KYSE30细胞中miR-3679-5p和FOXM1 mRNA的表达水平 采用Trizol试剂盒提取KYSE30细胞总RNA，逆转录成cDNA。以U6或GAPDH为内参，进行扩增检测，采用2-△△CT法计算miR-3679-5p和FOXM1 mRNA相对表达水平。引物序列：FOXM1正向引物：5’-CGTCGGCCACTGATTCTCAAA-3’，反 向 引 物：5’-GGCAGGGGATCTCTTAGGTTC-3’；U6正 向 引 物：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，反 向 引 物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’；GAPDH正向引物：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，反 向 引 物：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；miR-3679-5p正向引物：5’-TTCCCTGCCATATCCTCA-3’，反 向 引 物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，实验重复4次。

1.4 克隆形成实验检测KYSE30细胞的增殖能力 取待测KYSE30细胞，将细胞以1×103个/孔接种于96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养14 d后，肉眼可见克隆形成后停止培养，每孔加入1 ml甲醛固定细胞，加入1 ml结晶紫溶液染色。流水冲去残余染液，室温下晾干，拍照并计数每组克隆形成数，实验重复4次。

1.5 双染流式细胞术检测KYSE30细胞的凋亡 收集各组待测KYSE30细胞，采用磷酸缓冲盐溶液清洗，加入600μl结合缓冲液重悬，加入10μl Annexin V-FITC试剂孵育10 min，加入10μl PI试剂孵育10 min，采用流式细胞仪检测各组KYSE30细胞的凋亡水平，实验重复4次。

1.6 生物信息学方法预测miR-3679-5p的靶基因采用在线miRNA预测软件starBase v2.0（http：//starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php）预测miR-3679-5p可能调控的靶基因。

1.7 Western blotting检测FOXM1蛋白表达水平 收集各组待测KYSE30细胞，加入600μl细胞裂解液提取总蛋白。每组取30μg蛋白样本采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白条带，电转法将目的蛋白转至硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶封闭1.5 h，加入一抗在4℃下孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下孵育1.5 h。加入化学增强型发光液显影、拍照。

1.8 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组细胞中miR-3679-5p的表达水平 RT-qPCR检测结果（图1）显示，miR-3679-5p组和NC组KYSE30细胞中miR-3679-5p的相对表达水平分别为（8.65±0.68）和（1.09±0.31），miR-3679-5p组KYSE30细胞中miR-3679-5p的表达水平较NC组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 miR-3679-5p组和NC组KYSE30细胞中miR-3679-5p的表达水平

2.2 过表达miR-3679-5p对KYSE30细胞增殖能力的影响 克隆形成实验结果（图2）显示，NC组和miR-3679-5p组克隆形成数分别为（105.70±13.57）个和（48.46±12.79）个，差异有统计学意义（P＜0.05），提示过表达miR-3679-5p可降低KYSE30细胞的增殖能力。

图2 克隆形成实验检测两组KYSE30细胞的增殖能力

2.3 过表达miR-3679-5p对KYSE30细胞凋亡能力的影响 双染流式细胞术检测结果（图3）显示，NC组和miR-3679-5p组KYSE30细胞凋亡率分别为（5.48±1.34）%和（19.37±2.66）%，差异有统计学意义（P＜0.01），提示过表达miR-3679-5p可促进KYSE30细胞的凋亡。

图3 双染流式细胞术检测两组KYSE30细胞的凋亡能力

2.4 生物信息学方法预测miR-3679-5p的靶基因通过在线miRNA预测软件starBase v2.0预测显示，FOXM1可能是miR-3679-5p直接的作用靶点，miR-3679-5p和FOXM1的结合位点见图4。

图4 starBase v2.0在线软件预测miR-3679-5p与叉头框蛋白M1（FOXM1）的结合区域

2.5 两组KYSE30细胞中FOXM1 mRNA的表达水平RT-qPCR检测结果显示，miR-3679-5p组和NC组KYSE30细胞中FOXM1 mRNA的相对表达水平分别为（0.18±0.04）和（1.02±0.07），miR-3679-5p组KYSE30细胞中FOXM1 mRNA的表达水平较NC组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），提示过表达miR-3679-5p能够抑制FOXM1的表达。

2.6 两组KYSE30细胞中FOXM1蛋白的表达 如图5，与NC组相比，miR-3679-5p组KYSE30细胞中miR-3679-5p表达升高后，FOXM1蛋白表达显著降低，增殖表型蛋白CDK1表达下调，凋亡表型蛋白如Bcl-2、Bcl-w表达下调。

图5 Westernblotting检测两组KYSE30细胞叉头框蛋白M1（FOXM1）蛋白表达

3 讨 论

近年来大量研究发现，miRNA在鼻咽癌、淋巴瘤、骨肉瘤等各种恶性肿瘤中表达上调或下调，负责调节肿瘤细胞的恶性生物学行为，在肿瘤的发生及进展过程中扮演重要角色［8-10］。越来越多的miRNA被发现在食管癌中异常表达，表现为抑癌基因或癌基因作用［11］。Gao等［12］报道，miR-105在食管癌组织和细胞系中表达上调，miR-105过表达与淋巴结转移、临床分期和总生存率显著相关，miR-105过表达促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Wu等［13］报道，食管癌肿瘤组织和细胞中miR-10b表达上调，抑制miR-10b可增强食管癌细胞在体外和体内对顺铂的化学敏感性。Li等［7］研究表明，miR-3679-5p在结直肠癌细胞中是一个抑癌性miRNA。miR-3679-5p在食管癌中功能并不清楚。

本研究发现，过表达miR-3679-5p可抑制食管癌KYSE30细胞的增殖并促进其凋亡，发挥抑癌基因功能。miRNA可靶向互补结合并抑制靶基因表达，调控细胞的增殖和凋亡［14］。本研究通过生物信息学预测显示，FOXM1可能是食管癌细胞中miR-3679-5p的作用靶点。FOXM1基因定位于12p13.3，其蛋白由110个氨基酸组成，FOXM1蛋白是FOX转录因子家族蛋白成员［15］。FOXM1在乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中高表达，促进肿瘤的发生和发展［16-17］。FOXM1蛋白在食管癌组织中表达上调，抑制FOXM1表达可显著抑制食管癌细胞的增殖和转移［18］。本研究采用RT-qPCR检测显示，上调miR-3679-5p表达后，FOXM1表达明显降低。miR-3679-5p可显著抑制FOXM1的表达。本研究进一步发现，FOXM1蛋白表达下调后，KYSE30细胞增殖表型蛋白CDK1表达下调，KYSE30细胞凋亡表型蛋白如Bcl-2、Bcl-w表达下调，提示miR-3679-5p表达上调可抑制KYSE30细胞增殖并促进其凋亡。

综上所述，miR-3679-5p在食管癌组织和细胞株中表达下调，FOXM1是食管癌中miR-3679-5p的直接作用靶点，过表达miR-3679-5p可通过下调FOXM1的表达，抑制食管癌KYSE30细胞的增殖和凋亡。miR-3679-5p可能是食管癌潜在的分子治疗靶点。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。