RNA m6A甲基化修饰对三氧化二砷抑制肝癌细胞发生的作用研究

伍鑫 张琰君 国滨 徐振华 肖静丽

广州中医药大学金沙洲医院 510000

通信作者：伍鑫，Email：8035192@qq.com

m6A甲基化修饰是RNA修饰中普遍存在的一种方式，其对维持mRNA的功能方面具有重要作用。m6A甲基化修饰具有可逆性，其发生三种调节因子如甲基转移酶14/3（METTL14/METTL3）、去甲基化酶（FTO/alkbh5）和阅读蛋白（YTHDF1/YTHDF2）等进行调节［1］。目前大量研究发现，m6A不仅参与正常细胞的生长调控，同时还参与肿瘤细胞的发生及发展，m6A甲基化紊乱容易增加肿瘤细胞的癌变［2-3］。肝癌是危害性较大的恶性肿瘤疾病，有研究发现FTO通过调控m6A修饰从而影响肝癌的发生，肝癌组织中FTO水平上调可有效抑制肝癌的生长，METT14表达水平降低可引起肝癌细胞中m6A修饰水平下降［4］。基于m6A修饰及调控因子与肿瘤细胞发生相关性，许多肿瘤治疗药物的药效评定中多以m6A修饰及调控因子变化为参照，如三氧化二砷（ATO）是目前治疗肝癌的常用药物，但其抗肝癌的机理目前尚不清楚，有少量研究发现m6A甲基化修饰参与ATO抑制肝癌治疗过程，但这些信号分子调控m6A抑制肝癌细胞生长的还需进一步研究［5］。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 高糖DMEM培养基（美国Gibco公司，11054001）、FBS（美国Gibco公司，12483020）、ATO（美国Sigma公司，CAS#1327-53-3）、噻唑蓝（MTT）（碧云天，C0009）、二甲基亚砜（DMSO）（碧云天，ST1276）、CCK-8检测试剂盒（英国Abcam公司，ab228554），总RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司，74204）、m6A RNA甲基化定量检测试剂盒（美国Epigentek公司，P-9010）、RIPA细胞裂解液（碧云天，P0013B），人肝癌细胞株HepG2（中科院生物化学与细胞生物学研究所）；METTL3兔抗（英国Abcam公司，ab195352）、METTL14兔抗（英国Abcam公司，ab252562）、FTO兔抗（英国Abcam公司，ab126605）、YTHDF1兔抗（英国Abcam公司，ab252346）及CDC42兔抗（英国Abcam公司，ab187643），GAPDH鼠抗（英国Abcam公司，ab8245）；酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号MK3）、核酸定量检测仪Nano Drop（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号Nanodrop one/Nanodrop onec）、CO2培养箱（日本三洋，型号MCO-15AC）。

1.2 细胞四甲基偶氮唑蓝（MTT）活力检测 将人肝癌细胞株HepG2体外扩增后稀释至1×105个/ml接种于6孔板中4 ml/孔，继续培养至覆盖孔底70%左右，弃细胞上清，依据相关报道加入含有终浓度为20μM ATO的DMEM完全培养基，同时设立只加DMEM完全培养基的空白对照孔，2 ml/孔。ATO处理的HepG2细胞培养至0 h、6 h、12 h、24 h、48 h分别随机选取3个孔，去掉细胞上清加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT溶液2 ml/孔，继续孵育4 h后弃掉MTT，加入2 ml/孔DMSO于摇床震荡5 min后，以空白对照孔调零，于酶标仪上检测OD570值，根据公式细胞存活率（%）＝（处理组OD570/空白组OD570）×100%进行计算。

1.3 m6A甲基化定量检测 将经20μM ATO处理不同时间段的HepG2细胞用0.25%胰酶消化离心去上清后，使用总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA提取并于NanoDrop测量A230、A260及A280值，选取A260/280比值在1.8～2.2范围的样品孔，留取部分于-80℃备用。同时剩余部分依据m6A甲基化定量检测说明书将提取的总RNA进行处理，试剂盒中含有阴性及阳性对照组，经stop solution终止后的不同时间段样本置于酶标仪上进行OD450检测，根据公式m6A（%）＝［（OD处理组－OD阴性对照组）/200］/［（OD阳性对照组－OD阴性对照组）/2］×100%。

1.4 Western blot检 测METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白水平 将经20μMATO处理不同时间点的HepG2细胞消化离心后置于冰上加入终浓度均为1 mM蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，然后加入5×RIPA细胞裂解液轻弹管壁，充分裂解10 min后，经15 000 rpm离心10 min后弃上清（离心机型号：pico 17/21 176 mm），加入1 ml PBS沉淀重悬并转入1.5 ml ep管中，进行BCA法蛋白浓度测定，之后于15 000 rpm离心10 min后弃上清（离心机型号：pico 17/21 176 mm），加入1 ml loading buffer于电热浴槽98℃煮5 min使其变性。取6份等量的变性蛋白液（25μg）加入浓缩胶加样孔中，170 V电泳1～2 h，经SDS-PAGE电泳分离蛋白后，将胶取下转印到PVDF膜上，经5%BSA室温封闭1 h后，分别加入1∶1 000稀释的兔抗METTL3、兔抗METTL14、兔抗FTO、兔抗YTHDF1、兔抗Cdc42及鼠抗GAPDH，4℃过夜孵育，PBST洗膜4次约10 min，加入羊抗兔-HRP二抗和羊抗鼠-HRP二抗室温孵育1 h，PBST洗膜4次约10 min，加入AB显色液显色，凝胶成像系统拍照及统计蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 本研究采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，进行F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ATO处理不同时间段细胞存活率和m6A甲基化水平变化比较 由表1可知，经ATO处理后的0～24 h内，随着处理时间延长，HepG2的细胞存活率呈显著下降趋势（P＜0.05），而HepG2细胞的RNA m6A甲基化水平呈显著上升趋势（P＜0.05）；在ATO处理后的24～48 h内，HepG2细胞存活率呈下降趋势，RNA m6A甲基化水平呈上升趋势，但两个时间点的变化不显著（均P＞0.05）。

表1 ATO处理不同时间段HepG2细胞存活率变化（%±s，n＝3）

表1 ATO处理不同时间段HepG2细胞存活率变化（%±s，n＝3）

注：ATO为三氧化二砷；a代表与0 h比较P＜0.05，b代表与6 h比较P＜0.05，c代表与12 h比较P＜0.05

指标细胞存活率m6A水平0 h 93.32±4.12 0.27±0.04 6 h 85.01±5.03a 0.58±0.09 a 12 h 49.14±5.23ab 0.96±0.10ab 24 h 24.00±4.74abc 1.21±0.11abc 48 h 18.34±3.33abc 1.43±0.24abc

2.2 ATO处理后HepG2细胞METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42表达水平变化比较 由表2可知，随着ATO处理时间增加，HepG2细胞中METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1的相对表达量呈上升趋势，而Cdc42呈下降趋势；METTL3和FTO在ATO处理的12～48 h的相对表达量均显著高于0 h（均P＜0.05），METTL14和YTHDF1在ATO处理的6～48 h的相对表达量均显著高于0 h（均P＜0.05），Cdc42在ATO处理的6～48 h的相对表达量均显著低于0 h（均P＜0.05）。

表2 ATO处理不同时间段HepG2细胞的METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白表达量（±s，n＝3）

表2 ATO处理不同时间段HepG2细胞的METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白表达量（±s，n＝3）

注：ATO为三氧化二砷；a代表与0 h比较P＜0.05，b代表与6 h比较P＜0.05

蛋白表达量METTL3 METTL14 FTO YTHDF1 Cdc42 0 h 0.43±0.07 0.44±0.08 0.38±0.06 0.44±0.07 0.76±0.08 6 h 0.56±0.10 0.63±0.09a 0.48±0.07 0.61±0.07a 0.61±0.09a 12 h 0.67±0.10a 0.79±0.09ab 0.60±0.10a 0.75±0.08ab 0.58±0.09a 24 h 0.71±0.11a 0.83±0.11ab 0.68±0.09a 0.79±0.09ab 0.51±0.09a 48 h 0.76±0.13a 0.94±0.11ab 0.73±0.11a 0.82±0.12ab 0.47±0.08a

3 讨 论

RNA m6A修饰是腺嘌呤的第6位氮原子受甲基转移酶催化发生的甲基化，此过程受3种蛋白酶参与调控，即甲基转移酶（METTL3/METTL14）、去甲基酶（FTO）和阅读蛋白（YTHDF）［6］。有研究发现剔除Hla细胞中METTL14后m6A甲基化水平显著降低，但是去甲基化是否对细胞的生长有影响仍需深入研究［7］。目前有少量研究证实m6A修饰的擦除基因FTO被剔除后，细胞中mRNA的m6A甲基化水平显著下降，在肝癌细胞的m6A研究中，抑制YTHDF1的表达更有利于提升肝癌患者的生存率，但是当METTL14过表达会抑制肝癌细胞的迁移和侵袭［8］。基于上述调控蛋白表达水平与细胞生物学功能变化的相关性报道，近年来有少量研究开始将癌症疗效判定与上述指标的变化进行深入分析，如代黄梅等［9］使用不同浓度的ATO作用于对数生长期肝癌细胞发现METTL14表达水平与肝癌细胞的m6A甲基化修饰水平呈正相关，同时ATO浓度在10～20μmol/L时的HepG2细胞存活率下降幅度最大。何佳等［10］利用CCK-8法证明ATO对HepG2的半抑制浓度（IC50）为8.0μmol/L，并证明此浓度下作用时间越长细胞的凋亡越多且HepG2细胞的迁移蛋白表达量限制下降。

本研究基于相关报道，对20μmol/L ATO作用于肝癌HepG2细胞株后不同时间段的RNA m6A的甲基化水平及调控蛋白水平综合比较，结果随着处理时间延长，HepG2的细胞存活率呈显著下降趋势（P＜0.05），而HepG2细胞的RNA m6A甲基化水平呈显著上升趋势（P＜0.05），但是在ATO处理后24 h和48 h的HepG2细胞存活率及RNA m6A甲基化水平变化不显著，此结果初步证实20μmol/L ATO处理后6～24 h可显著降低HepG2细胞存活率及RNA m6A甲基化水平，但是当处理时间影响不显著。在20μmol/L ATO水平下，随着处理时间增加，HepG2细胞中METTL3、METTL14、FTO及YTHDF1的相对表达量呈上升趋势，而Cdc42的相对表达量呈下降趋势，此结果进一步证实HepG2甲基化水平与HepG2的凋亡呈对立走势；METTL3和FTO在ATO处理的12～48 h的相对表达量均显著高于0 h（均P＜0.05），METTL14和YTHDF1在ATO处理的6～48 h的相对表达量均显著高于0 h（均P＜0.05），Cdc42在ATO处理的6～48 h的相对表达量均显著低于0 h（均P＜0.05），此结果证实METTL14、YTHDF1及Cdc42表达水平变化对ATO抑制HepG2细胞增殖疗效的判定中起到早期参考价值。

综上所述，ATO可显著影响肝癌HepG2细胞RNAm6A的甲基化水平。在20μmol/LATO水平下，随着ATO作用时间增加，HepG2细胞存活率显著下降，其中m6A调控酶METTL14、YTHDF1及迁移蛋白Cdc42的早期表达水平变化显著，这些指标对ATO抑制肝癌早期疗效评定具有指导意义。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。