下调环状RNA circ-BTG2对肾癌细胞增殖和迁移的影响及其机制

赵云飞 徐祖伟 黄耿 桂定文 姜卫东 付金伦 彭伟 万京桦鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）泌尿外科 45000；肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，黄石 45000；武汉科技大学职业危害识别与控制湖北省重点实验室 40065

肾癌是世界范围内最常见的泌尿系统肿瘤之一，发病率及病死率呈逐年升高［1］。基因治疗是肾癌研究的新方向。环状RNA（circRNA）是一类保守的小分子序列，呈闭环结构，能够有效调控基因的表达，导致细胞生物学行为发生变化［2］。肾癌与circRNA的异常表达直接相关，circRNA在肾癌的发生和发展中产生重要影响［3］。目前仅有少部分circRNA在肾癌中的作用得到了证实，使得以circRNA为靶点的靶向治疗成为了肾癌研究者共同关注的重点［4］。circ-BTG2是一种新发现的circRNA，circ-BTG2在肾癌中的作用及机制并不清楚。本研究通过实验研究下调circ-BTG2对肾癌细胞生物学性状的影响及具体机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 肾癌786-O细胞株购于上海中科院细胞库；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）相关试剂盒购于日本TaKaRa公司；circ-BTG2抑制剂（GATAACAGGGTAACGCTGTCT）和无义对照序列由广州市锐博生物科技有限公司合成；转染试剂Lipofectamine RNAiMAX购于美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司；一抗购于美国BD公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒和二甲基亚砜购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.2 细胞培养和分组 786-O细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，培养条件为5%CO2、37℃。将对数生长期786-O细胞接种至24孔板，依据Lipofectamine RNAiMAX的说明将无义对照序列和circ-BTG2抑制剂转染，命名为对照组和实验组。

1.3 qRT-PCR检测circ-BTG2和Grb2协同结合蛋白2（Grb2-associated binding protein-2，GAB2）信 使RNA（mRNA）的表达 选择Trizol试剂提取786-O细胞总RNA，进一步合成cDNA，依据qRT-PCR相关试剂盒的说明进行扩增。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 MTT法检测细胞活性 取对数生长期的转染后786-O细胞，分别以5×103个/孔接种96孔板，连续5 d MTT检测。每孔分别加入MTT溶液，培养箱孵育3.5 h。采用移液器吸去溶液，每孔分别加入二甲基亚砜，在振荡器上快速震荡30 min。在490 nm波长处，利用酶标仪检测细胞的吸光度（A）值。

1.5 Transwell迁移实验检测786-O细胞迁移能力 取对数生长期的转染后786-O细胞，采用不含FBS的RPMI 1640培养基重悬786-O细胞，以1×104个/孔接种于Transwell上室，在下室加含血清的RPMI 1640培养基。培养24 h。利用甲醇固定、结晶紫染色，利用棉签擦去未穿过微孔膜的786-O细胞，在光学显微镜（×100）下拍照、计数。

1.6 Western blotting检测GAB2蛋白和AKT/mTOR信号通路蛋白表达 取对数生长期的转染后786-O细胞，依据蛋白提取试剂盒说明书分别提取各组786-O细胞总蛋白，设定电泳参数，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶中电泳以分离蛋白，采用电转法将分离后的蛋白转至聚偏二氯乙烯膜。利用10%的脱脂牛奶进行封闭。采用适量封闭液制备一抗，在4℃孵育12 h。洗膜后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗羊抗兔，室温下孵育1.5 h，滴加发光液，利用凝胶成像系统曝光、显影。

1.7 统计学方法 利用SPSS 17.0统计学软件对所有数据进行统计分析，计量资料符合正态分布，以（±s）表示，两组间比较均采用独立样本t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 qRT-PCR检测转染后786-O细胞中circ-BTG2的表达 在786-O细胞株中，对照组与实验组中circ-BTG2表达 量 分 别 为（1.70±0.20）和（0.44±0.09），实 验 组circ-BTG2表达被明显抑制（t＝5.69，P＜0.01），见图1。

图1 转染阴性对照无义序列（对照组）及circ-BTG2抑制剂（实验组）后786-O细胞中circ-BTG2的表达

2.2 MTT法检测转染后786-O细胞增殖情况 MTT分析结果显示，与对照组786-O细胞相比，实验组786-O细胞转染circ-BTG2后第2天开始，786-O细胞的增殖水平下降（t＝3.86，P＜0.05），见图2。

图2 circ-BTG2对786-O细胞增殖情况的影响

2.3 Transwell迁移实验检测转染后786-O细胞的迁移情况 Transwell迁移实验分析显示，对照组和实验组迁移786-O细胞数分别为（94.91±15.34）个和（25.48±6.60）个，实验组迁移细胞数明显减少（t＝4.16，P＜0.01），这表明circ-BTG2可导致786-O细胞迁移能力明显降低，见图3。

图3 circ-BTG2对786-O细胞迁移情况的影响（×100）

2.4 qRT-PCR检测转染后786-O细胞中GAB2 mRNA的表达 在786-O细胞株中，对照组与实验组中GAB2 mRNA表达量分别为（2.86±0.24）和（1.27±0.18），实验组GAB2 mRNA表达被明显抑制（t＝5.25，P＜0.01）。

2.5 Western blotting检测GAB2蛋白和AKT/mTOR信号通路蛋白的表达 与对照组786-O细胞相比，实验组786-O细胞中GAB2蛋白表达明显降低，AKT/mTOR信号通路蛋白如p-AKT蛋白、p-mTOR蛋白表达明显降低，见图4。

图4 Western blotting检测GAB2蛋白及AKT/mTOR信号通路蛋白相对表达

3 讨 论

circRNA广泛存在于动植物细胞内，直接影响细胞的分化、增殖、发育等生物学功能［5］。越来越多的circRNA被证实在肾癌中异常表达，在肾癌的发生、发展中起到了非常重要的调控作用［6］。Sun等［7］报道，circ-SCARB1在肾癌组织和细胞系中升高，敲除circ-SCARB1抑制细胞增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞凋亡，miR-510-5p是circ-SCARB1的靶标。Liu等［8］报道，肾癌细胞系和组织中circPTCH1表达上调，其高水平表达的患者生存率降低，circPTCH1可在体外和体内诱导肾癌细胞迁移和侵袭能力增加。circ-BTG2是一种新发现的长链非编码RNA（lncRNA），circ-BTG2在肾癌细胞中作用及机制尚未见报道。

本研究显示，下调circ-BTG2能够抑制肾癌细胞的增殖和迁移，表明circ-BTG2高表达可能参与肾癌的发生和发展。GAB2蛋白由1 870个氨基酸构成，其在多种恶性肿瘤如卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌中存在过量表达，与肿瘤的分期、分级相关，沉默GAB2蛋白可显著抑制肿瘤细胞的增殖和转移［9-10］。Mu等［11］报道，miR-218通过抑制GAB2蛋白表达抑制肾癌细胞的恶性生物学行为，GAB2在肾癌中表现为癌基因作用。本研究结果表明，下调circ-BTG2可明显抑制GAB2基因的表达。AKT/mTOR信号通路在肾癌细胞的恶性转化中发挥关键作用［12］。GAB2蛋白表达被抑制后，AKT/mTOR信号通路蛋白表达明显降低，表明AKT/mTOR信号通路被抑制。

综上所述，本研究证实过表达circ-BTG2有助于抑制肾癌细胞的增殖和侵袭，其具体机制可能与抑制GAB2基因表达相关。circ-BTG2的深入研究可能为肾癌的基因治疗提供新的突破口。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。