番茄红素对糖尿病肾病大鼠内质网应激的影响*

刘艳峰，段丽萍，郭艳敏，周 虎

（邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者最常见的微血管并发症之一，是引发终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要因素[1]。目前，DN早期干预主要以控制血糖和血压、调整饮食为主，DN终末期则以血液透析或肾脏移植等肾脏替代疗法为主[2]。然而血液透析可诱发心脑血管意外，肾脏移植费用高且存在排异反应，对并发症改善效果并不显著[3]。

病理生理学研究发现，DN发生发展与炎症反应和细胞凋亡密切相关[4-5]，而内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是炎症反应和细胞凋亡的重要信号通路[6]。番茄红素是自然界广泛存在的一种类胡萝卜素，具有较强的抗炎、抗凋亡活性，并且对ERS具有抑制作用[7-8]。本课题组既往研究发现番茄红素能够通过抑制氧化应激对DM大鼠肾损伤起到保护作用[9]。本研究旨在探讨番茄红素对DN大鼠ERS的影响，以丰富其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物7周龄SPF级雄性SD大鼠65只，体质量210～240 g，购自河北省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（冀）2019-003。实验动物饲养于邯郸康业制药有限公司，动物使用许可证号：SYXK（冀）2018-004，饲养环境温度25℃，相对湿度55%～65%，光照黑暗各12 h交替，分笼饲养1周后开展实验。本研究经邯郸市中心医院伦理委员会审核批准，批件号：HDZX[K]字2020-017。

1.2 药物与试剂番茄红素（南京泽朗生物科技有限公司，纯度≥96%，批号：ZL201900837a）；四苯基丁酸（批号：SML0309）、链尿佐菌素（批号：024K1211）均购自美国Sigma公司；24 h尿蛋白量（UPro）试剂盒（批号：201912017）、尿素氮（BUN）试剂盒（批号：202003009）、肌酐（SCr）试剂盒（批号：202001013）均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；TUNEL试剂盒（批号：191125）、ECL超敏发光试剂盒（批号：190825）、C反应蛋白（CRP）ELISA试剂盒（批号：200116）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（批号：191031）、白介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（批号：191207）均购自南京建成生物工程研究所；糖调节蛋白78（GRP78）抗体（批号：bs-1219R）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）抗体（批号：bs-1630R）、核因子-κB（NF-κB）抗体（批号：bs-0465R）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）抗体（批号：bs-1105R）、β-actin抗体（批号：bs-0061R）均购自北京博奥森生物科技有限公司。高糖高脂饲料（67.5%常规饲料加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇）[河北省实验动物中心，许可证号：SYXK（冀）2018-003]。

1.3 主要仪器Sure Step Plus型血糖仪（美国强生公司）；VARIOSKANLUX型多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；BS-300型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；CUT4062型石蜡切片机（德国SLEE公司）；DYCZ-24DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司）；Chem Doc XRS型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 造模与分组随机取55只SD大鼠给予高糖高脂饲料喂养4周后，禁食禁水12 h，30 mg/kg腹腔注射浓度1%的链尿佐菌素，72 h后检测血糖≥16.7 mmol/L，尿糖为+++或++++，即认定DN大鼠造模成功[10]；最终造模成功52只大鼠（造模成功率94.55%，造模过程死亡1只，未成模2只），分别剔除血糖值最高和血糖值最低各1只大鼠后，将剩余50只DN模型大鼠按血糖值分层随机分为模型组、四苯基丁酸组、番茄红素低剂量组、番茄红素中剂量组、番茄红素高剂量组，每组10只。剩余10只大鼠设为正常对照组，给予常规饲料喂养。

1.5 实验给药四苯基丁酸组大鼠灌胃给予质量浓度为200 mg/mL的四苯基丁酸溶液[11]，番茄红素低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予质量浓度为2、4、8 mg/mL的番茄红素溶液[12]，正常对照组和模型组大鼠均灌胃给予生理盐水，各组大鼠灌胃给药量均为5 mL/kg，1次/d，连续8周。

1.6 观察指标

1.6.1 血糖水平检测 各组大鼠均于给药前和给药后第7、14、28、56天通过尾静脉采血，使用血糖仪测定血糖水平。

1.6.2 UPro和血清BUN、SCr含量检测 末次给药后，收集各组大鼠24 h尿液并采用磺基水杨酸法测定UPro值；末次给药24 h后，腹腔注射水合氯醛实施麻醉，经腹主动脉取血，2 000 r/min离心10 min取血清，通过全自动生化分析仪检测血清BUN、SCr含量。

1.6.3 肾组织病理学检查和肾细胞凋亡观察 采集血液标本后，颈椎脱臼处死并取双侧肾组织，左肾置于10%甲醛溶液中固定72 h，石蜡浸润包埋后行4 μm厚度连续切片，经二甲苯透明和梯度乙醇脱蜡后，分别进行HE染色、TUNEL染色。（1）HE染色：梯度乙醇脱水和二甲苯透明后由中性树胶封固，然后通过光学显微镜观察肾组织病理学形态结构改变。（2）TUNEL染色：参照TUNEL试剂盒说明书进行染色处理，梯度乙醇脱水和二甲苯透明后由50%甘油封固，然后通过光学显微镜观察肾细胞凋亡状况；凋亡指数（apoptosis Index，AI）计算：每张切片取5个互不重叠的视野并分别计数视野内凋亡细胞数和细胞总数，取平均值，AI（%）=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。

1.6.4 肾组织炎症细胞因子含量检测 右侧肾脏于冰上剪碎后，加入冷裂解液后研磨匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，参照试剂盒说明书进行处理后，采用ELISA法，通过酶标仪检测肾组织CRP、TNF-α、IL-1β水平。

1.6.5 肾组织蛋白表达检测 取肾组织匀浆液，加入RIPA裂解液提取总蛋白并通过BCA法检测总蛋白浓度，然后通过Western blotting法检测蛋白表达：10% SDS-PAGE胶电泳行蛋白分离、湿法转PVDF膜、5%蛋白免疫印迹封闭液室温封闭2 h，洗膜后滴加GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12、β-actin抗体4℃孵育12 h，洗膜后滴加二抗37℃孵育1 h，洗膜后滴加ELC发光剂后，通过凝胶成像仪显示蛋白条带，以β-actin为内参、通过条带灰度值半定量GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12相对表达量。

1.7 统计学方法运用SPSS 15.0软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠空腹血糖水平比较给药前及给药后第7、14、28、56天，模型组大鼠空腹血糖水平明显高于正常对照组（P＜0.01）；给药前，模型组，四苯基丁酸组和番茄红素低、中、高剂量组大鼠空腹血糖水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。大鼠给药前后不同时间点空腹血糖水平比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在时间效应，四苯基丁酸组和番茄红素中、高剂量组均如此。各组大鼠间空腹血糖水平总体比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在分组效应。分组因素与时间因素存在交互效应（P＜0.01），变化趋势相同；随时间增加，四苯基丁酸组和番茄红素低、中、高剂量组大鼠空腹血糖水平逐渐降低；随番茄红素给药剂量的增加，空腹血糖水平逐渐降低。（见表1、图1）。

表1 各组大鼠空腹血糖水平比较（±s，mmol/L）

表1 各组大鼠空腹血糖水平比较（±s，mmol/L）

注：F时间主效应=5.638，P时间主效应=0.002；F分组主效应=126.505，P分组主效应=0.000；F交互效应=11.704，P交互效应=0.000；与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与四苯基丁酸组比较，dP＜0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg） 给药前 第7天 第14天 第28天 第56天 F P正常对照组 10 - 5.59±0.81 5.70±0.83 5.68±0.79 5.71±0.78 5.69±0.83 0.036 0.997模型组 10 - 18.07±1.52a 17.92±1.63a 17.76±1.60a 17.80±1.65a 17.68±1.67a 0.089 0.985四苯基丁酸组 10 1 000 18.13±1.69 16.68±1.59 16.51±1.55 14.93±1.46b 14.17±1.30c 10.464 0.000番茄红素低剂量组10 10 17.92±1.48 17.41±1.58 17.05±1.52 16.72±1.51 16.57±1.49 1.294 0.287番茄红素中剂量组10 20 18.35±1.65 16.93±1.61 16.28±1.47b 15.10±1.38c 13.84±1.28c 13.491 0.000番茄红素高剂量组10 40 18.06±1.74 16.57±1.63 15.16±1.24c 12.95±1.19cd 11.03±1.02cd 39.035 0.000 F 103.297 95.038 78.372 72.775 58.645 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 各组大鼠空腹血糖水平的交互效应轮廓图

2.2 各组大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量比较与正常对照组比较，模型组大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量均升高（P＜0.01）；与模型组比较，四苯基丁酸组和番茄红素中、高剂量组大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量均降低（P＜0.01）；番茄红素低剂量组大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；番茄红素高剂量组大鼠UPro和血清中BUN、SCr含量与四苯基丁酸组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠UPro及血清中BUN、SCr含量比较（±s）

表2 各组大鼠UPro及血清中BUN、SCr含量比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）UPro（mg/24 h）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）正常对照组 10 - 9.58±1.37 5.36±1.04 27.15±3.52模型组 10 - 25.03±3.86a 21.37±3.95a 50.83±6.41a四苯基丁酸组 10 1 000 13.57±3.46b 11.84±2.71b 40.92±5.62b番茄红素低剂量组10 10 22.68±4.62 18.53±4.17 46.71±5.87番茄红素中剂量组10 20 17.49±3.81b 14.09±3.24b 40.75±5.14b番茄红素高剂量组10 40 12.93±3.17b 10.25±2.40b 37.08±5.01b

2.3 各组大鼠肾组织病变情况比较正常对照组大鼠肾小管和肾小球形态结构均未见异常；模型组大鼠肾小管可见蛋白管型和细胞管型，间质区可见炎症细胞浸润，上皮细胞肿胀并呈现空泡变性，肾小球明显增大，可见系膜和基底膜增生、内皮细胞泡沫样变；与模型组比较，四苯基丁酸组和番茄红素低、中、高剂量组大鼠肾小管和肾小球形态结构病变不同程度改善，四苯基丁酸组和番茄红素高剂量组效果优于番茄红素低、中剂量组。（见图2）

图2 各组大鼠肾组织病理性形态结构改变（HE，×400）

2.4 各组大鼠肾细胞凋亡状况比较经TUNEL染色，细胞核黄褐色着色为凋亡细胞。正常对照组大鼠肾组织可见极少量凋亡细胞；模型组大鼠肾组织凋亡细胞数量明显增多，与正常对照组比较，模型组大鼠AI升高（P＜0.01）；与模型组比较，番茄红素低、中、高剂量组和四苯基丁酸组大鼠肾组织可见凋亡细胞数量不同程度减少，其中四苯基丁酸组和番茄红素中、高剂量组AI降低（P＜0.01），且番茄红素高剂量组AI明显低于四苯基丁酸组（P＜0.05）。（见图3、表3）

图3 各组大鼠肾细胞凋亡状况（TUNEL，×400）

表3 各组大鼠肾细胞AI比较（±s）

表3 各组大鼠肾细胞AI比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与四苯基丁酸组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）AI（%）正常对照组 10 - 3.47±0.59模型组 10 - 52.08±6.75a四苯基丁酸组 10 1 000 16.71±3.03b番茄红素低剂量组10 10 47.69±6.12番茄红素中剂量组10 20 28.40±4.74b番茄红素高剂量组10 40 13.92±2.58b c

2.5 各组大鼠肾组织炎症细胞因子含量比较与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织CRP、TNF-α、IL-1β水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，四苯基丁酸组和番茄红素中、高剂量组大鼠肾组织CRP、TNF-α、IL-1β水平均降低（P＜0.01）；番茄红素低剂量组大鼠肾组织CRP、TNF-α、IL-1β水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；番茄红素高剂量组大鼠肾组织CRP、TNF-α、IL-1β水平与四苯基丁酸组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠肾组织炎症因子含量比较（±s）

表4 各组大鼠肾组织炎症因子含量比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）CRP（mg/g）IL-1β（ng/g）TNF-α（ng/g）正常对照组 10 -模型组 10 -四苯基丁酸组 10 1 000番茄红素低剂量组10 10番茄红素中剂量组10 20番茄红素高剂量组10 40 40.83±5.16 11.49±1.70 42.86±5.12 187.29±30.54a 40.67±6.48a 88.25±11.47a 102.93±20.17b 21.06±3.80b 62.18±9.53b 165.91±28.05 37.46±7.11 84.92±13.75 137.35±23.64b 27.82±5.36b 68.07±10.94b 94.68±16.85b 19.35±3.42b 56.26±8.41b

2.6 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白表达比较与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相对表达量均升高（P＜0.01）；与模型组比较，四苯基丁酸组和番茄红素中、高剂量组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相对表达量均降低（P＜0.01）；番茄红素低剂量组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相对表达量与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；番茄红素高剂量组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相对表达量与四苯基丁酸组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见图4、表5）

表5 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相对表达量比较（±s）

表5 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白相对表达量比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

组别 动物数（只） 给药剂量（mg/kg）GRP78/β-actin CHOP/β-actin NF-κB/β-actin Caspase-12/β-actin正常对照组 10 - 0.09±0.03 0.13±0.04 0.14±0.03 0.11±0.02模型组 10 - 1.07±0.15a 0.94±0.16a 1.16±0.18a 1.02±0.13a四苯基丁酸组 10 1 000 0.19±0.04b 0.35±0.08b 0.57±0.09b 0.29±0.06b番茄红素低剂量组 10 10 0.98±0.17 0.81±0.17 1.08±0.17 0.91±0.12番茄红素中剂量组 10 20 0.53±0.11b 0.60±0.13b 0.85±0.14b 0.78±0.10b番茄红素高剂量组 10 40 0.17±0.04b 0.32±0.06b 0.61±0.10b 0.34±0.07b

图4 各组大鼠肾组织GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-12蛋白表达Western blotting图

3 讨 论

我国DM患病人数约1.4亿，其中30%～50%DM患者并发不同程度DN，已成为威胁人们生命健康的主要慢性疾病之一[13]。黄强等[14]研究发现高血糖刺激炎症细胞因子大量释放、肾细胞凋亡在DN进展过程中发挥着重要作用。因此，以抑制炎症反应和细胞凋亡为治疗靶点对抑制DN具有至关重要的作用。

番茄为药食两用植物，其主要活性成分番茄红素具有良好的抗炎、抗氧化、抗凋亡、提高免疫力等生物学活性[15]。本研究发现，DN模型大鼠肾小管可见蛋白管型和细胞管型，间质区可见炎症细胞浸润，上皮细胞肿胀并呈现空泡变性，与郭啸华等[16]研究报道一致。给予四苯基丁酸或番茄红素治疗4周后能够明显降低DN大鼠空腹血糖水平，并且番茄红素的作用具有一定的剂量依赖性和时间依赖性；给予四苯基丁酸或番茄红素治疗8周能够明显改善肾功能指标（降低UPro和血清BUN、SCr含量），改善肾组织形态结构病变并降低肾细胞凋亡水平，提示番茄红素对DN大鼠肾组织损伤具有保护作用。

内质网是真核细胞中普遍存在的一种膜性细胞器，是调控炎症反应、细胞凋亡的重要病理通路。庞欣欣等[17]研究发现，DN大鼠肾组织损伤与ERS相关。GRP78是存在于内质网的钙离子伴侣蛋白，当内质网过度应激时将导致大量错误折叠和未折叠的蛋白蓄积，而诱导GRP78过度合成，因此GRP7升高可作为ERS标志检测物。CHOP是一种促凋亡信号分子，能够激活Caspase-12而启动细胞凋亡，而ERS能够诱导CHOP上调表达[18-19]。ERS能够诱导NF-κB上调表达，而NF-κB分子中的p65亚基能够与DNA特异位点结合而诱导单核细胞、巨噬细胞大量合成与释放炎症因子CRP、TNF-α、IL-1β，TNF-α、IL-1β则能够刺激粒细胞大量合成与释放炎症因子，形成炎症级联反应[20]。本研究发现，给予四苯基丁酸或番茄红素治疗8周能够明显下调DN大鼠肾脏组织GRP78、CHOP、Caspase-12、NF-κB表达，降低CRP、TNF-α、IL-1β含量，提示番茄红素能够抑制DN大鼠肾组织ERS和炎症反应。

综上所述，番茄红素能够抑制DN大鼠肾组织ERS通路及其介导的炎症反应和细胞凋亡，这可能是番茄红素对DN大鼠肾损伤具有保护作用的重要分子机制。