杜仲治疗股骨头坏死分子机制的网络药理学研究*

黎永华，尹 恒，谭仁霆，黄世福，邱金龙

（1.儋州市中医医院，海南 儋州 571700；2.南京中医药大学，江苏 南京 210023）

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是好发于中青年的骨科难治性疾病，目前认为其发病主要与髋部外伤、酗酒、糖皮质激素使用等因素相关[1]。股骨头内血流障碍，造成局部骨细胞、骨小梁坏死，逐渐发展并导致股骨头生物力学性能失衡，发生塌陷，髋关节功能障碍，严重影响患者身心健康[2]。人工全髋关节置换术是ONFH晚期有效的治疗方式，但远期面临关节翻修问题[3]。中医药治疗早中期股骨头坏死的疗效肯定，并在缓解疼痛、改善功能、防止塌陷进展等方面开展了较多研究[4]。

股骨头坏死属于中医学“骨蚀”范畴，其病因病机目前尚无统一观点，多认为其发病与“虚”“痰”“瘀”等因素相关，主要辨证为肝肾亏虚、气血亏虚、痰瘀阻络、气滞血瘀等证型[5-6]，补肝肾、化痰浊、行气血等治法贯穿于股骨头坏死的中医药治疗。杜仲有补肝肾、强筋骨之功，在股骨头坏死的中医药治疗中被广泛应用[7-9]。现代药理研究认为杜仲提取物能抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，改善骨坏死内部微循环[10-11]，但杜仲治疗ONFH的药效物质基础、分子机制等目前尚未明确。逐一对杜仲具体成分进行实验验证必将消耗大量时间和精力。本研究基于系统生物学、网络药理学理论，筛选预测杜仲治疗股骨头坏死的活性成分及作用靶标，并对靶标进行富集分析，建立成分-疾病-靶标网络，探究其潜在作用机制，旨在为后续实验研究提供方向。

1 资料与方法

1.1 杜仲活性成分与作用靶点预测 通过中药系统药理学成分分析平台（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/）对杜仲的活性成分及其对应作用靶点进行预测。

BATMAN-TCM是由北京蛋白组学研究中心开发的中药分子机理生物信息学分析工具，其主要功能包括：（1）中药成分对应靶标基因的预测；（2）靶标基因的生物学功能分析；（3）可视化分析中药成分-靶标基因-生物学功能网络；（4）对比分析多个中药。BATMAN-TCM数据库建立中药成分-靶标基因互作预测模型，系统分析中药成分三维化学分子结构，将其与经临床或实验验证的药物小分子交互对比，预测中药成分潜在的作用靶标基因，不局限于已知的中药成分作用靶标基因关系，以获得更加全面的中药成分作用关系数据，帮助全面系统理解中药的多成分-多靶点分子作用机制[12]。

在BATMAN-TCM中以“Du Zhong”（杜仲）为检索词，“Herb”（草药）为输入格式，检索Score Cutoff设置为20，以P＜0.05为有效靶点预测置信区间，检索获得杜仲的活性成分及其作用靶点信息，保存数据整理备用。1.2股骨头坏死疾病靶标基因预测 分别在人类基因组数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）、基因关联数据库（GAD，https://geneticassociationdb.nih.gov/）、基因学库（Gene，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）等多个公认的汇集疾病遗传组信息与治疗靶点的在线数据库[13]中，以“Osteonecrosis of the femoral head”或“ONFH”或“Femur Head Necrosis”为检索词运行检索，预测ONFH的疾病治疗靶标基因，保存数据整理备用。

1.3 杜仲活性成分-股骨头坏死靶标基因网络构建 将从BATMAN-TCM获得的中药杜仲活性成分作用靶点，与GeneCards、GAD、Gene等数据库分别获得的ONFH疾病靶标基因交集，获得杜仲活性成分治疗ONFH作用靶点。

利用蛋白互作在线工具STRING（https://string-db.org/）进行上述获得的杜仲活性成分治疗ONFH作用靶点的蛋白互作关系（Protein-Protein Interaction，PPI）网络构建。在STRING中输入获得的全部靶标基因，物种限定为“Homo sapiens”（人类），运行分析，将分析结果与已获得的杜仲活性成分对应靶点信息汇总整理，导入至可视化网络分析软件Cytoscape 3.6.1中，通过软件的Network Analyzer进行杜仲活性成分-股骨头坏死靶标基因网络构建。

1.4 靶标基因通路富集与基因本体论分析 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），包含大量基因组高通量测序数据，是目前公认的细胞、生物、生态系统功能信息数据库，可获取基因在各信号通路富集的信息[14]。基因本体论（Gene Ontology，GO），是广泛应用于描述基因产物的功能注释与分类的系统，主要包括细胞组成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及生物过程（Biological Process，BP）3个部分[15]。

通过蛋白基因生物信息整合分析平台DAVID Bioinformatics Resources 6.8[16]（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行杜仲活性成分治疗ONFH靶标基因的KEGG信号通路富集与GO功能注释分析。在DAVID在线网站输入所有获得的靶标基因，物种限定为“Homo sapiens”（人类），运行分析后下载保存数据结果。对数据进行筛选，以P＜0.05认为该富集通路或注释功能具有统计学意义。

2 结 果

2.1 杜仲活性成分及其治疗股骨头坏死靶标基因 于BATMANTCM进行杜仲活性成分条件性检索，最终获得杜仲活性成分38个，包括松脂醇（Pinoresinol）、木黄酮（Genistein）、己六醇（Dulcitol）、可布酮（Kobusone）等。（见表1）

表1 杜仲活性成分

由于杜仲各活性成分化学名称较长，故以代替名称如DZ1等进行编号，方便后续网络分析。上述38个杜仲活性成分共作用于856个疾病靶标基因，通过与GeneCards、GAD、Gene等数据库获得的股骨头坏死疾病靶标基因取共交集，最终获得杜仲活性成分治疗ONFH目标靶标基因17个，包括NOS1、IL10、IL4、FGF2、PPARG、HIF1A、ABCB1、SOX9、TP53、TNF、F2、CTNNB1、BMP2、SREBF1、APOA1、TGFB1、CYP3A4。

2.2 杜仲活性成分作用靶点网络可视化 将BATMAN-TCM获得的杜仲38个活性成分及其对应疾病作用靶点856个之间的作用关系以Excel格式导入至Cytoscape 3.6.1软件中，运行Network Analyzer进行杜仲活性成分与作用靶点关系网络的可视化分析。图中黄色三角形节点分别代表杜仲38个活性成分，紫色圆形节点代表活性成分作用靶点，节点间连线代表彼此间存在作用关系，所有节点与连线共同构成杜仲活性成分作用靶点的网络关系。（见图1）

图1 杜仲活性成分-疾病作用靶点关系网络图

2.3杜仲治疗股骨头坏死靶标基因互作网络可视化 将获得的17个杜仲治疗ONFH靶标基因上传至STRING网站，运行分析，将靶标基因互作关系结果保存下载，导入到Cytoscape 3.6.1中，运行Network Analyzer，使用cytoHubba插件对靶标基因进行Degree值计算，根据Degree值对各靶标基因之间的互作关系进行可视化分析。（见图2）

cytoHubba基于网络拓扑结构对靶标基因进行Degree值与连接度计算分析，以此揭示靶标基因在互作关系中的重要性与联系强度[17]。Degree值越大，则认为该靶标基因重要性越显著，连接度越高则认为靶标基因间互作关系越强。图2中各圆形节点分别代表不同的靶标基因，节点颜色各不相同。靶标基因Degree值越大则节点直径越大，其颜色越接近于暖色系，反之则Degree值越小，节点直径越小，代表色接近冷色系。不同节点间根据联系强度以不同颜色粗细的连线相联系，连接度越大，连线则越粗，颜色越接近于暖色系。结果显示，TNF、TP53、FGF2、PPARG、TGFB1依次为Degree值大小排名前5名的靶标基因，TNF与NOS1、ABCB1，TP53与CYP3A4之间存在较强的连接度。

图2 杜仲治疗股骨头坏死靶标基因互作网络图

2.4 杜仲活性成分-股骨头坏死靶标互作网络可视化 将上述获得的38个杜仲活性成分中与17个治疗ONFH靶标基因有直接作用关系的成分，与STRING获得的靶标基因互作关系整理后导入至Cytoscape 3.6.1中，运行Network Analyzer，将杜仲活性成分之间作用于ONFH的关系网络可视化。在杜仲38个活性成分中，与股骨头坏死靶标基因存在直接作用关系的成分有8个，分别为异麦芽糖、咖啡酸二甲醚、灵猫酮、银松素、去氧甘草次酸、γ-谷甾醇、三十烷醇、表奎尼丁。在网络图中以内圈的黄色三角形节点表示，外圈绿色圆形节点为17个ONFH靶标基因，节点间以连线连接表示其作用关系。（见图3）

图3 杜仲活性成分-股骨头坏死靶标互作网络图

2.5 靶标基因通路富集结果分析 将获得的17个杜仲治疗ONFH靶标基因上传至DAVID 6.8在线数据库，运行KEGG通路富集分析，最终获得125个富集通路，经过检验统计筛选出104个通路有统计学差异（P＜0.05）。对这104个通路根据P值从小到大进行排序，将排名前5位的通路富集结果通过开放式通路分析软件FunRich3.1.3[18]以柱状图呈现。图中横坐标展示多配体蛋白聚糖介导信号通路（proteoglycan syndecan-mediated signaling events）、磷脂酰基醇蛋白聚糖网络（glypican 1 network）、凝血酶/蛋白酶激动受体信号通路（thrombin/protease activated receptor pathway）、PAR1介 导 凝 血 酶 信 号 通 路（PAR1-mediated thrombin signaling events）、磷脂酰肌醇聚糖信号通路（glypican pathway）5个富集的KEGG信号通路，纵坐标表示在该通路上富集的基因占总的输入基因比例，各富集通路P值标注于柱形图上。（见图4）

图4 靶标基因通路富集柱状图

2.6 靶标基因的基因本体论结果分析 清空DAVID 6.8在线数据库KEGG运行结果，继续行靶标基因的基因本体论GO分析，将所有GO分析结果保存下载。最终共获得196个GO功能注释结果，经统计学检验，获得14个具有统计学差异的GO功能注释，将此结果以可视化形式呈现。图中纵坐标分别表示具有统计学意义的GO注释功能，如生长因子活性（growth factor activity）、酶结合（enzyme binding）等，横坐标表示功能注释的P值，横纵坐标交汇节点表示各功能注释，该功能注释上富集的基因越大则节点越大，P值越小则其颜色越接近红色。（见图5）

图5 靶标基因的基因本体论结果可视化图

3 讨 论

骨组织结构破坏与生物力学性能失衡，是股骨头坏死的重要表现，晚期将出现髋关节软骨、软骨下骨破坏塌陷。保髋手术、人工髋关节置换是目前中晚期ONFH的重要治疗方式[19]。中医药在治疗早中期ONFH方面备受肯定，并仍有巨大的发展潜力。杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，其味甘，性温，入肝肾经，《神农本草经》称之“主腰脊痛，补中益精气，坚筋骨，强志，除阴下痒湿，小便余沥”，将杜仲列为上品。杜仲在ONFH的临床治疗中被广泛应用。本研究立足于杜仲治疗ONFH的临床疗效，借助中药系统药理学成分分析平台BATMAN-TCM，基于平台对杜仲活性成分与疾病靶标基因互作模型预测，获得杜仲有效活性成分38个，疾病作用靶标856个。

BATMAN-TCM是功能强大的中药分子机理生物信息学分析工具，其独特的中药成分分子作用靶标预测模型可帮助获得药物分子与未知的疾病靶标基因潜在互作关系，获得系统全面的中药分子作用靶标基因网络。目前同类型研究中常用的TCMSP数据库[20]主要基于中药分子的药代动力学特性如口服生物利用度等指标进行中药活性成分的筛选，但该数据库仅支持注册的中草药数据检索，部分动物源中药（如龟甲、鹿角等）则无法提供药理数据分析。BATMAN-TCM提供基于中药成分三维化学结构的疾病作用靶标基因预测，同时收录有更加全面的中药单味药、复方、单体及其靶标数据，并可在线可视化分析靶标基因的基因本体论、信号通路富集结果，功能全面。

将BATMAN-TCM预测的杜仲成分靶标基因与各人类基因组数据库筛选获得的ONFH疾病靶标基因相映射，最终获得杜仲的咖啡酸二甲醚等8个活性成分与17个股骨头坏死靶标基因存在直接作用关系。从杜仲活性成分-股骨头坏死靶标互作网络图可知，咖啡酸二甲醚、灵猫酮、表奎尼丁等多个活性成分能作用于多个ONFH靶标基因，而TNF、TGFB1、SOX9等靶标基因能同时与多个杜仲活性成分相联系，杜仲活性成分治疗ONFH可能存在着协同作用，通过不同信号通路的不同靶点发挥共同的治疗作用。

从杜仲治疗ONFH的17个靶标基因互作网络关系可知，杜仲治疗ONFH的机制复杂，不同靶标之间存在直接或间接的协调调控作用，TNF、TP53、FGF2、PPARG、TGFB1等是网络中Degree值最高的前5位靶标，是网络中的核心靶标，在ONFH疾病治疗的生物学过程中发挥着多通路协作调控的重要作用。如肿瘤坏死因子（TNF）具有炎症介导作用，YUAN L等[21]研究发现TNF-α、IL-10等细胞因子基因突变与汉族人ONFH易感性密切相关；PPARG基因与类固醇代谢、血管生成等生物过程相关。研究[22]认为PPARG高表达是ONFH的危险因素；转化生长因子β1是调控细胞生长分化的重要因子，在TGF-β/Smad信号通路调控前体细胞成骨分化、抑制破骨细胞活性的过程承担重要作用[23]，与ONFH的骨修复重建相关。

机体的组织、细胞、代谢因子等物质之间存在复杂的信号通路调控网络，互相协作或抑制以发挥相应功能，这与中医核心理念“整体观念”相契合。从KEGG通路富集结果来看，杜仲治疗ONFH的17个靶标基因共富集于125个信号通路，其中有104个经检验具有统计学差异，这些信号通路主要集中在细胞的增殖凋亡、癌症相关、血管生成及凝血相关、免疫、炎症、代谢等生物学过程。（1）调控骨代谢：成骨细胞-破骨细胞耦联的骨重建-骨吸收稳态平衡是ONFH治疗的关键点之一，破骨细胞分化（osteoclast differentiation）、调控干细胞多能性的信号通路（signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、细胞周期（cell cycle）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK signaling pathway）均有较显著的富集。Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞成骨分化、抑制成脂分化[24]；研究[25]表明激活MAPK信号通路通过提高ALP、BMP2等成骨相关蛋白表达，促进成骨细胞矿化过程；破骨细胞分化、细胞增殖凋亡周期调控与成骨细胞-破骨细胞稳态平衡关系密切，杜仲活性成分可能通过相关信号通路恢复ONFH的骨重建-骨吸收失衡，促进骨重建，抑制骨吸收，修复骨坏死。（2）血管生成调控：ONFH发病与股骨头血液循环欠佳密切相关，缺氧缺血是发病的关键环节，HIF-1α信号通路耦联血管生成与骨代谢平衡，可作用于生长板软骨细胞促进血管内皮生成因子表达从而促进血管生成[26-27]。杜仲活性成分可能有改善ONFH病程中股骨头局部微循环、促进血管新生的作用。（3）炎症代谢调控：改善ONFH局部特殊炎症环境对其治疗转归具有重要意义。NF-kappa B、T细胞受体等信号通路是重要的炎症介导与免疫调控通路。炎症因子诱导NF-κB活化，促进破骨细胞增殖活动[28]；T细胞受体信号通路调控机体免疫应答、炎症因子释放、杀伤靶细胞等生物学过程[29]；杜仲苷、杜仲醇提物可抑制NF-κB、T细胞受体通路，减轻局部炎症[30]。以上可能是其治疗ONFH的潜在机制。

从靶标基因富集的GO生物学过程来看，杜仲治疗ONFH主要与药物反应、核酸的转录调控、生长因子活性、酶结合、细胞代谢因子活性等联系紧密，与前述各富集的信号通路调控机体的生物学活动相吻合，是进一步探索杜仲活性成分治疗ONFH潜在机制的重要环节。

综上所述，杜仲治疗ONFH存在多成分、多靶点、多通路等特点，各活性成分、靶标基因存在一定协同调控或拮抗调控作用，主要涉及的骨代谢平衡、血管生成、炎症免疫调控等信号通路之间存在复杂相互作用，可能在股骨头局部、机体全身发挥调控作用。杜仲治疗ONFH的潜在分子机制复杂，本研究初步对相关机制进行总体探索，希望为后续具体实验验证提供思路与方法。