逐瘀止痛远红外灸贴体外透皮实验研究*

毕建云，赵东升，武雪静，张 静

（1.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355；2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；3.中国药科大学，江苏 南京 211198）

血府逐瘀汤出自清代王清任的《医林改错》，该方剂作为理血剂具有化瘀止痛的功效。血府逐瘀汤由桃仁、红花、当归等11味药材组成，其功用涉及心脑血管、消化、神经、妇科、骨科等多个系统[1-2]。逐瘀止痛远红外灸贴是在原方的基础上，采用一种方便实用，效果显著的外用贴膏剂作为载体，辅助物理加热，穴位灸贴的方式，治疗原发性痛经[2]。体外透皮性能是评价经皮给药制剂生物利用度高低的重要指标，也是控制制剂质量的重要途径。药物经皮扩散过程复杂，影响因素很多[3]。为了解逐瘀止痛远红外灸贴的透皮吸收情况，本实验进行了体外透皮试验研究，对组方中有效成分芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的透皮吸收特性进行了考察。

1 材 料

1.1 药物与试剂 氮酮（郑州津北化工有限公司）；芍药苷（批号：FY1265VX53J，供含量测定用，南通飞宇生物科技有限公司）；阿魏酸（批号：110773-201915，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；藁本内酯（批号：181216，供含量测定用，中国药品生物制品鉴定所）。甲醇、乙腈为色谱纯，娃哈哈纯净水。

1.2 主要仪器LC-20A型液相仪（含SPD-20A紫外可见检测器、LC-20AT泵和LC-Solution工作站，日本岛津）；FA2004B电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；HH-4数显电子恒温水浴锅（江苏金坛市晶玻实验仪器厂）；ZNCL-BS型恒温磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）；FA2004B电子分析天平（上海赫尔普国际贸易有限公司）；改良型Franz扩散池（自制）。

1.3 实验动物 正常健康7周龄SPF级健康小鼠70只，雌雄各半，体质量18~22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号：鲁动质syxk（鲁）20190003号。适应性饲养条件：室温保持21~24℃，湿度保持45%左右，明暗周期12 h，予以普通饲料饲养，自由进食、饮水。实验中所涉及的小鼠实验均经实验动物管理委员会批准。

2 方法与结果

2.1 供试皮肤的制备 将小鼠背部毛用剃须刀剃毛后，脱颈椎处死，剥离整个皮肤并除去皮下脂肪组织、血管及内膜等，用蒸馏水冲洗，再用生理盐水反复冲洗后使用。

2.2 体外透皮实验研究 采用改良型Franz扩散装置（接受室体积为18.0 mL，接受室有效接触面积为2.54 cm2），固定装置。将新鲜制备好的离体鼠皮用生理盐水洗净，用脱脂棉吸干表面水分，将逐瘀止痛远红外灸贴贴于皮肤表面，然后将其固定在Franz扩散池中间，使角质层朝向供给池。接受室加满预温37℃的50%乙醇生理盐水，磁力搅拌器保持恒温恒速。分别于2、6、8、12、16、24 h将接受液全部取出，平行4份，每次合并接受液，蒸干，用甲醇溶解并定容至1 mL，以0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，进样测定，并计算累积渗透量[4-5]。

2.3 芍药苷、阿魏酸、藁本内酯透皮渗透量测定

2.3.1 色谱条件 芍药苷与阿魏酸的色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85）；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：20μL；柱温：30℃。芍药苷的相对保留时间为18.0 min，阿魏酸的相对保留时间为33.6 min[6-8]。

藁本内酯的色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：325 nm；柱温：25℃；进样量：20μL。藁本内酯的相对保留时间为8.4 min[9]。

2.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取芍药苷、阿魏酸、藁本内酯对照品，配成浓度分别为1.045 0、0.486 5、2.002 0μg/mL的对照品溶液。

2.3.3 线性关系考察 精密移取不同浓度的芍药苷、阿魏酸、藁本内酯对照品10μL，芍药苷进样量分别为0.002 77、0.005 66、0.011 00、0.020 00、0.031 20、0.040 00μg；阿魏酸进样量分别为0.006 40、0.001 34、0.002 45、0.004 96、0.009 60、0.020 10μg；藁本内酯进样量分别为0.000 56、0.001 06、0.002 58、0.004 97、0.009 56、0.040 00μg，以进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。得线性回归方程分别为Y=2 323 363X+5.61，r=0.999 9；Y=37 624 211X-300.4，r=0.999 9；Y=804 264.8X+330.8，r=0.9999。结果芍药苷、阿魏酸、藁本内酯分别在0.002 77～0.040 00、0.006 40～0.020 01、0.000 56～0.040 00μg范围内线性关系良好。

2.3.4 专属性考察 取去除赤芍、川芎、当归以外的其他药材，按逐瘀止痛远红外灸贴的制法制成缺赤芍、川芎、当归空白样品，按“2.2”透皮实验方法操作，制成透皮24 h空白溶液。精密吸取透皮吸收供试品溶液、空白溶液、对照品溶液各10μL，按上述色谱条件测定，结果对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间有相应的峰，空白对照无干扰峰。说明该测定方法的专属性好、无干扰。（见图1~2）

图1 芍药苷和阿魏酸的HPLC图

2.3.5 精密度试验 精密吸取同一透皮吸收供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样5次，测得峰面积，结果芍药苷RSD为1.64%，阿魏酸RSD为1.16%，藁本内酯RSD为0.96%。表明仪器精密度良好。

图2 藁本内酯的HPLC图

2.3.6 稳定性试验 精密吸取同一透皮吸收供试品溶液，按0、2、4、8、12、24 h分别进样，测定色谱峰面积，结果芍药苷RSD为1.66%，阿魏酸RSD为1.61%，藁本内酯RSD为0.91%。表明样品溶液在24 h内保持稳定。

2.3.7 重复性试验 采用“2.2”项下体外透皮实验方法，制备6份24 h透皮吸收液分别进样，测定色谱峰面积，计算24 h芍药苷、阿魏酸及藁本内酯的透过量，结果芍药苷RSD为1.78%，阿魏酸RSD为1.61%，藁本内酯RSD为1.02%。表明该体外透皮实验方法可行。

2.3.8 加样回收率试验 取芍药苷16.110 mg、阿魏酸7.988 mg、藁本内酯3.530 mg，精密称定，分别置于20 mL容量瓶中，用50%乙醇生理盐水溶解并定容，摇匀，制备对照品储备液，精密量取适量上述对照品储备液制成每毫升含芍药苷16.79、33.57、40.30μg；阿魏酸8.32、16.64、19.9μg；藁本内酯3.678、7.355、8.825μg的对照品溶液。精密量取上述3种对照品溶液2.0 mL，各3份，精密加入空白基质，按照“2.2”项下的实验方法制备透皮24 h的样品，按照“2.3.1”项下的测定方法记录色谱图，计算含量，测定回收率。结果可知芍药苷的平均回收率为97.15%，RSD为1.05%；阿魏酸的平均回收率为96.83%，RSD为0.86%；藁本内酯的平均回收率为96.60%，RSD为0.58%。说明方法回收率良好，符合要求。（见表1）

表1 3种成分回收率试验结果

续表1：

2.4 氮酮用量和接收介质的考察

2.4.1 氮酮用量的考察 逐瘀止痛远红外灸贴制备过程中，选择加入0、1%、3%、5%的氮酮溶液，以芍药苷、阿魏酸及藁本内酯Q24及增渗倍数为考察指标，筛选氮酮的加入量[10]。根据实验数据可知，氮酮对芍药苷、阿魏酸及藁本内酯均有一定的促透作用，3%氮酮对三者的促透作用均优于5%的氮酮，综合促透效果及经济效益最终选择3%氮酮为宜。（见表2）

表2 氮酮用量的考察（μg/cm2）

2.4.2 接受介质的选择 选择以生理盐水30%、50%、70%的生理盐水乙醇溶液为透皮接受液，以芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的Q24为考察指标，筛选最适宜的接受介质。根据实验数据可知，选择50%生理盐水乙醇溶液为宜。（见表3）

表3 接收介质的考察（μg/cm2）

2.5 透皮吸收渗透动力学模型拟合 按照“2.2”项下的方法进行实验，分别在1、2、6、8、12、16、24 h将接受液全部取出，平行4份，每次合并接受液，接受液蒸干，用甲醇溶解并定容至1 mL，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，测定接收液中芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的浓度，计算各个时间点的累积透过量，并进行方程拟合[11-12]。

累积透过量Q对t1/2进行回归，得线性方程分别为芍药苷：Q=1.258t1/2-3.392，r=0.990 9；阿魏酸：Q=0.605t1/2-1.627，r=0.996 1；藁本内酯：Q=0.252t1/2-0.401，r=0.996 6。即三者的Q与t1/2均具有相关性。说明三者从逐瘀止痛远红外灸贴中向离体小鼠皮肤渗透符合Higuich方程，均具有较好的体外透皮性能。芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的Q24分别为26.429、13.103、5.790μg/cm2。以时间t为横坐标，各时刻芍药苷、阿魏酸、藁本内酯Q24为纵坐标，绘制逐瘀止痛远红外灸贴的经皮渗透曲线，由图可以看出，3种成分的透皮量藁本内酯<阿魏酸<芍药苷，这也与各成分的提取量有关。（见图3）

图3 芍药苷、阿魏酸及藁本内酯经皮渗透曲线图

3 讨 论

影响药物透皮吸收的因素主要来自药物、给药系统和皮肤3个方面。药物本身的性质是决定药物透皮透过速率的主要因素，但同时药物透皮吸收也受药物在给药系统中的分散状态、系统中介质对药物的亲和力及皮肤差异等条件的制约。药物相对分子质量＜400、油水分配系数（以正丁醇-水为分配体系测得）的对数值（lgP）1～4为宜，一般认为药物的油/水分配系数大，脂溶性大的药物易溶解在角质层，并易扩散通过。芍药苷（分子量：480）、阿魏酸（分子量：194）及藁本内酯（分子量：190，lgP=2.64±0.06）中后两者具有较好的透皮性能，但是研究发现芍药苷也具有较好的皮肤透过性。有研究发现芍药苷在慢性压迫性损伤大鼠中，可通过调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路缓解神经性疼痛；阿魏酸可以抑制磷脂酶A2（PLA2），从而阻止花生四烯酸的游离，阻断生成血栓素A2（TXA2），从而抑制血小板聚集与释放，具明显的抗血栓作用。藁本内酯对缩宫素所致正常雌性小鼠子宫平滑肌剧烈收缩具有明显的拮抗作用，可使小鼠扭体反应的潜伏期缩短，次数减少，显示其对实验性痛经模型小鼠具有镇痛作用[13-14]。

在促渗剂的选择中，氮酮安全价廉易得，并且不与贴膏中的其他药用成分产生反应，所以成型中作为首选。研究过程中也考察过桉叶油，但是无论是成型还是对芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的促透方面都不及氮酮，因此最终确定氮酮作为促透剂。按成型工艺确定的方法，在逐瘀止痛远红外灸贴混合稠膏中加入设计量的氮酮，使氮酮占总膏体的量分别为0、1%、3%、5%制得不同氮酮含量的贴膏，发现氮酮含量为3%时芍药苷、阿魏酸及藁本内酯的Q24较大，加入5%氮酮三者的Q24反而下降，这就表明氮酮的促透作用与其浓度有一定关系，但又不完全为剂量依赖性，对于不同的药物要选择其最佳的促透浓度。这也符合文献中氮酮的促透规律。同时处方中的挥发油也有较好的促渗作用，并且可能与氮酮促渗作用机制相似，都是作用于角质层的脂质双分子层，干扰脂质分子的有序排列，增加脂质的流动性，有助于药物分子的扩散[15]。