木犀草素对慢性肾衰竭大鼠的保护作用

李秀文，李达丽

（新疆医科大学第六附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000）

慢性肾衰竭是由于长期肾实质慢性、进行性的损伤导致的肾小球滤过率降低，由此引起肾脏内环境稳态及代谢功能发生紊乱而导致的一种临床综合征，是各种慢性肾脏疾病的最终结局，进而逐渐导致机体各器官功能衰竭而严重危及生命安全[1-4]。目前肾脏替代治疗在慢性肾衰竭的治疗中发挥了重要的作用[5]，但是在进行肾脏替代治疗前如何采取有效治疗措施延缓肾衰竭进展，保护残存的肾脏功能具有至关重要的意义。炎症是慢性肾衰竭重要的始动因素，持续的微炎症状态，促进了肾脏的纤维化及肾脏损伤，推动了肾衰竭的进展[6]。木犀草素是天然的黄酮类化合物，广泛存在于许多天然植物中，包括菊花、薄荷、迷迭香、百里香、松柏植物和蕨类植物等，具有抗氧化、抗菌、抗炎症等作用[7-8]，但是其对慢性肾衰竭是否具有保护作用的研究还较少，为此本研究拟探讨木犀草素对慢性肾衰竭大鼠的保护作用，并研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物6~8周龄SPF级Wistar健康雄性大鼠30只，体质量160~180 g，购于卡文斯百格（苏州）模式动物研究有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0002，所有大鼠于18~24℃通风良好的SPF级动物房内适应性饲养1周。实验经新疆医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：LFYLLSC20191209-01。

1.2 药物与试剂 木犀草素（成都普利斯生物科技有限公司，货号：M-007，含量＞98%）；羧甲基纤维素钠（山东森美生物科技有限公司生产，货号：FL20）；腺嘌呤（美国Sigma公司，货号：A8626）；白介素-6（IL-6）试剂盒（货号：ml102828）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（货号：ml-002859）、尿素氮（BUN）试剂盒（货号：ml-01049）、血肌酐（SCr）试剂盒（货号：ml058879）（上海酶联生物科技有限公司）；兔抗TLR4单克隆抗体（货号：14358）、兔抗p-p65单克隆抗体（货号：3031）、兔抗p-IκB单克隆抗体（货号：76041）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，货号：2118）、HRP标记山羊抗兔IgG二抗（货号：7074）（美国CST公司）。木犀草素使用时加入羧甲基纤维素钠溶液配制成200、50 mg/kg混悬液。腺嘌呤使用时加入双蒸水配制成2.5%混悬液，放置在温度为4℃的冰箱当中，混合均匀方可使用。

1.3 主要仪器DHG-9003型电热恒温鼓风干燥箱（上海姚氏仪器设备厂）；LUX酶标仪、PCR仪、凝胶成像系统及定量PCR扩增仪（美国赛默飞公司）；移液枪、高速低温离心机（长沙东旺实验仪器有限公司）。

1.4 造模与分组 随机选取21只大鼠进行慢性肾衰竭模型建立：配制2.5%的腺嘌呤混悬液，以200 mg/（kg·d）的剂量对大鼠进行灌胃，连续30 d，建立大鼠慢性肾衰竭模型[9]；另取9只大鼠作为对照组，用生理盐水灌胃，于第30天随机选择3只对照组大鼠和3只模型大鼠处死，通过HE染色法观察大鼠肾组织病理变化，从而判断造模是否成功。造模成功后将18只大鼠随机分为模型组、木犀草素高剂量组、木犀草素低剂量组，每组6只。

1.5 实验给药 木犀草素高、低剂量组大鼠分别用200、50 mg/kg木犀草素混悬液灌胃[10]，对照组和模型组大鼠用生理盐水灌胃，持续灌胃15 d。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠行为学观察 给药期间持续观察各组大鼠饮食饮水状态、大小便情况、体态、行动状况、毛发颜色、毛发浓密情况；记录造模期间各组大鼠的死亡情况。

1.6.2 ELISA法检测大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、SCr含量 第15天给药1 h以后，将大鼠按体质量0.01 mL/g注射1%的戊巴比妥钠进行麻醉，取麻醉后的大鼠腹主动脉血5 mL，按照3 000 r/min的转速进行离心，离心时间为15 min，离心取血清，采用ELISA法检测大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、SCr含量。

1.6.3 HE染色观察大鼠肾脏组织病理变化 各组大鼠分别脱颈处死，各取出部分肾组织，将肾组织分别用体积百分比为4%的多聚甲醛固定，石蜡包理，5μm厚连续切片，苏木精-伊红（HE）染色后光镜下观察肾组织病理形态变化。

1.6.4 Western blotting法检测大鼠肾脏组织中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表达水平 将蛋白样品解冻以后，加等体积的2×SDS上样缓冲液，在100℃温度中煮沸5 min以达到蛋白变性的目的，然后按照40μg/孔进行加样，采用SDS/PAGE凝胶电泳法进行电泳，将其转移到PVDE膜，对膜进行封闭处理，然后加入兔抗大鼠TLR4一抗（稀释度1∶200），放置在4℃恒温环境中，放置过夜，再加入稀释度为1∶10 000的二抗，放置在室温环境中2 h，然后采用显色剂进行显色，显色时间为1 min，随后用蒸馏水进行洗涤，采集图像并保存，采用凝胶图像分析成像系统进行相关分析，将GAPDH作为内参，TLR4和GAPDH面积光密度比值代表TLR4蛋白表达情况。p-p65、p-IκB蛋白表达水平检测方法同TLR4。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料采用（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，采用SNK-q检验进行两两之间的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠行为学观察 对照组大鼠体型圆润，动作灵敏，毛发细密有光泽，饮食及大小便正常，无死亡；模型组大鼠形态消瘦，动作迟缓，出现脱毛，且毛发粗糙无光，不思饮食，尿量较少，大便较稀，死亡2只；木犀草素低剂量组大鼠行为学与模型组无明显差别，死亡1只；木犀草素高剂量组大鼠体型正常，比对照组大鼠动作略微迟缓，毛发暗淡，并无脱毛现象，饮食正常，大便较稀，无死亡情况。存在大鼠死亡的组别均选取相应数量大鼠在相同条件下进行重新造模和给药补足数量。

2.2 各组大鼠血清BUN、Scr含量比较 与对照组比较，模型组及木犀草素低、高剂量组大鼠血清中BUN和Scr含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素高剂量组大鼠血清中BUN和Scr含量明显下降（P＜0.05）；木犀草素低剂量组大鼠血清中BUN和Scr含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠血清BUN和Scr含量比较（±s）

表1 各组大鼠血清BUN和Scr含量比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）对照组 6 - 6.93±0.44 37.02±1.23模型组 6 - 17.28±0.71a 180.83±9.26a木犀草素低剂量组6 50 16.55±0.69a 176.60±10.05a木犀草素高剂量组6 200 11.47±0.86a b 92.02±10.39a b

2.3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较 与对照组比较，模型组及木犀草素低、高剂量组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素高剂量组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明显下降（P＜0.05）；木犀草素低剂量组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清IL-6和TNF-α含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清IL-6和TNF-α含量比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）对照组 6 - 21.72±3.29 29.50±3.48模型组 6 - 61.24±4.49a 76.46±6.24a木犀草素低剂量组 6 50 58.61±3.56a 72.33±5.72a木犀草素高剂量组 6 200 38.99±3.32ab 42.54±3.93ab

2.4 各组大鼠肾脏组织病理变化 对照组大鼠肾脏体积正常，颜色为正常的深红色；模型组大鼠肾脏组织体积增大，苍白无血色，大量炎性浸润，间质纤维化，肾小囊腔扩张严重；木犀草素高剂量组大鼠肾脏组织炎性浸润较少，肾小囊腔呈现轻度扩张，间质纤维化程度较轻，肾脏组织有血色；木犀草素低剂量组大鼠肾脏病理情况与模型组基本一致。（见图1）

图1 各组大鼠肾脏组织病理变化（HE，×200）

2.5 各组大鼠肾组织TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况 与对照组比较，模型组及木犀草素低、高剂量组大鼠肾脏组织TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素高剂量组大鼠肾脏组织中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表达水平明显下降（P＜0.05）；木犀草素低剂量组大鼠肾脏组织TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表达水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图2、表3）

图2 各组大鼠肾组织TLR4、p-p65及p-IκB蛋白电泳条带

表3 各组大鼠肾组织TLR4、p-p65及p-IκB蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织TLR4、p-p65及p-IκB蛋白表达比较（±s）

注:与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）TLR4 p-p65 p-IκB对照组 6 - 0.10±0.01 0.21±0.02 0.15±0.02模型组 6 - 1.50±0.06a 1.50±0.06a 0.96±0.07a木犀草素低剂量组6 50 1.45±0.06a 1.48±0.05a 0.96±0.05a木犀草素高剂量组6 200 0.40±0.05ab 0.80±0.05ab 0.30±0.03ab

3 讨 论

慢性肾衰竭病位主要在肾，且与脾紧密相关，最终可累及五脏六腑。中医学中慢性肾衰竭的发病因素包括肾气不足和感染风寒暑湿燥火六淫。现代医学认为慢性肾衰竭的病理表现主要为肾脏纤维化，包括肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化等[11-12]。目前慢性肾衰竭的发病机制尚未完全阐明，其中炎症反应会导致肾脏组织损伤并促进肾衰竭的进展已被证实[13]。研究发现[14]核转录因子信号通路能够调控核内相关靶基因的转录或者表达，对炎症介质的生成具有显著影响，能促进炎症反应发生，从而使得肾脏组织持续处于微炎症状态，导致肾脏组织纤维化，加剧肾脏损伤，促进肾衰竭的进展。

本研究发现模型组和木犀草素低剂量组大鼠均出现消瘦、脱毛、毛发粗糙无光，不思饮食，尿量较少，大便较稀，而木犀草素高剂量组和对照组大鼠状态基本一致，只有动作略微迟缓、毛发暗淡现象，提示高剂量（200 mg/kg）木犀草素能够明显改善慢性肾衰竭大鼠行为状态，降低死亡率。有研究表明，慢性肾衰竭导致肾脏功能受损，肾脏清除率降低，代谢产物、炎症因子等不能有效排出体外，导致血液中代谢产物、炎症因子等含量升高[15]。本研究发现，与对照组比较，模型组大鼠血清中BUN和Scr含量明显升高，表明肾脏排泄代谢产物的能力降低，肾脏功能恶化[16]；而且模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明显升高，病理组织学观察发现模型组大鼠肾脏组织体积增大，苍白无血色，大量炎性浸润，间质纤维化，肾小囊腔扩张严重，表明机体炎症水平高，肾脏处于炎症状态，进一步加重了肾脏纤维化及肾脏损伤[17]。与模型组比较，木犀草素高剂量组大鼠血清中BUN、Scr、IL-6、TNF-α含量明显下降，木犀草素低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），病理组织学观察发现木犀草素高剂量组大鼠肾脏组织炎性浸润较少，肾小囊腔呈现轻度扩张，间质纤维化程度较轻，肾脏组织有血色，而木犀草素低剂量组与模型组病理情况基本一致，故200 mg/kg的木犀草素具有抗炎作用，可以提高代谢产物的清除功能，同时促进代谢产物排泄等，进一步减少炎症因子在机体内的堆积，表明200 mg/kg的木犀草素可以明显改善慢性肾衰竭大鼠肾功能损伤，减轻炎症反应。

当肾小管受到氧化损伤以后，机体氧化应激机制启动，活性氧的活性得到加强，导致TLR4/NF-κB信号通路发生活化，促进炎症因子产生，加深氧化应激对肾脏的损伤，而且TLR4/NF-κB信号通路会促进肾小管上皮细胞转变成间充质，由此使得肾小管上皮细胞失去正常功能，而具备了间充质的功能，导致肾脏发生纤维化，随着病情进展，逐渐导致肾功能消失，出现肾衰竭，所以抑制TLR4/NF-κB信号通路对于减缓慢性肾衰竭的发生具有重要的意义[18]。TLR4/NF-κB信号通路激活和p-p65、p-IκB有关，因此可以通过检测p-p65、p-IκB水平发现激活该信号通路的途径[19-20]。本研究发现，与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表达水平明显著升高，TLR4/NF-κB信号通路被激活；与模型组比较，木犀草素高剂量组大鼠肾脏组织中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表达水平明显下降，而木犀草素低剂量组与模型组比较无明显变化。因此，200 mg/kg的木犀草素可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，改善慢性肾衰竭大鼠肾脏功能损伤。

综上所述，200 mg/kg的木犀草素能够改善慢性肾衰竭大鼠肾功能损伤，减轻炎症反应，其机制可能是抑制TLR4/NF-κB信号通路。