霾黄金中药茶对雾霾所致大鼠肺损伤模型的影响*

马婷婷，肖 凌，廖宗杰，吴剑锋

（湖北中医药大学检验学院，湖北 武汉 430065）

雾霾天气作为现代社会进步发展的产物，其组成成分复杂多样，且因地域季节而异，而细颗粒物PM2.5作为其重要的成分，严重威胁着人体健康。PM2.5的长时间暴露对呼吸系统疾病[1-2]、心血管系统相关疾病[3-4]等有较大影响。

PM2.5对呼吸系统损伤的机制主要包括炎性反应、氧化应激反应、免疫毒性及基因毒性[5]。其中PM2.5雾霾颗粒引起的肺部炎症反应最为直接，例如PM2.5进入肺泡被吞噬细胞吞噬可引起促炎症因子的释放，引发机体防御反应。但在这个机体防御的过程中同时也直接或间接地造成组织和细胞的损害，促使多种呼吸道疾病的发生。

中医针对雾霾，以预防为主，治法多为扶正祛邪、润燥化湿、排毒清肺，中医药具有明显优势[6]，且许多中药复方对肺损伤有效[7]。霾黄金中药茶主要由药食同源中药制成，成分包括罗汉果、芦根、百合、甘草、薏苡仁、陈皮、余甘子、玉竹，具有清肺润肺的功效，有望用于雾霾的防护，且在前期已经进行了相关的急性毒理试验[8]。

本实验通过非损伤性气管滴注进行SD大鼠的PM2.5雾霾颗粒染毒造模，对灌药组进行霾黄金中药茶溶液灌胃，最后主要通过检测TNF-α、IgM、IgG、GLO（球蛋白）等指标来探究霾黄金中药茶对雾霾所致大鼠肺损伤模型的防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物8~9周龄SPF级SD雌性大鼠40只，购自湖北省实验动物研究中心，动物合格证号：42000600036406，动物许可证号：SCXK（鄂）2015-0018，将大鼠在适宜条件下适应性喂养1周，体质量为（199.8±5.9）g。实验后水合氯醛麻醉后腹主动脉取血处死大鼠，且此实验经医学实验动物管理委员会批准。

1.2 药物与试剂 霾黄金（取自商品霾黄金伴侣茶，许可证编号：SC10642011801427）；PM2.5玻璃纤维滤膜2张（中国地质大学提供，分别于2019年3月9日和2019年3月10日每天进行24 h采样；平均温度为12.6℃，累计体积为1 504 m3；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（货号：MM-0180R）、大鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA试剂盒（货号：MM-0064R）、大鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA试剂盒（货号：MM-0065R）（江苏菲亚）；球蛋白（GLO）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号：180838）；气管滴注管（自制，用1 mL注射器去掉针头部分，套上尖端磨平的18 G留制针制成）。

1.3 主要仪器SCIENTZ-12型冷冻真空干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KQ3200型超声震荡仪（江苏省昆山市淀海湖镇）；MB-580型酶标仪（深圳市汇松科技发展有限公司）。

1.4 造模与分组 制备PM2.5混悬液：将采样好的PM2.5玻璃纤维滤膜2张（20 cm×25 cm），剪切成1 cm×1 cm大小的方块，经过无菌去离子水浸泡、超声震荡、过滤取滤液分装于EP管内，-80℃冰箱冻存3 h后置于真空冷冻干燥机冷冻干燥3 d，得干燥好的PM2.5无霾颗粒126 mg，将其溶于无菌去离子水中，配得10 mg/mL的混悬液。

将40只SPF级SD大鼠随机分为空白组、对照组、模型组、灌药组，每组10只。考虑到暂时还没有确定有效的防护雾霾的标准药物，因此实验未设置阳性对照组。在实验的第1、3、5天，用7%的水合氯醛以0.5 mL/100 g的剂量麻醉大鼠，待大鼠完全麻醉后，采用无创性气管滴注。将模型组与灌药组大鼠置于木板上取仰卧位固定，将木板与桌面成约75°角立起后用剃毛机剃除大鼠喉颈部毛发，用镊子提起大鼠的舌头，借助聚光笔照射大鼠喉颈部来找到大鼠气管，用自制滴注管滴注PM2.5混悬液，1 mL/kg，对照组大鼠滴注等量的无菌去离子水，空白组则不做处理。

1.5 实验给药 配置霾黄金中药茶溶液：人一日喝一袋（1.5g），实验中大鼠剂量设为人的20倍，此剂量在前期急性毒理试验[8]中的安全剂量范围内，且为预实验中探索的合适剂量，参考徐叔云主编的《药理实验方法学》的体表面积换算法，计算得大鼠剂量为2.7 g/kg。大鼠每次的灌胃量为2 mL，大鼠体质量约200 g，所以每次配置270 mg/mL的霾黄金中药茶溶液。灌药组大鼠从实验第1天起每天用270 mg/mL霾黄金中药茶溶液灌胃2 mL，连续10 d，对照组和模型组则灌胃等量去离子水，空白组不做处理。

1.6 观察指标 第11天，用7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉大鼠，打开大鼠腹腔用加抗凝剂的真空采血管取大鼠腹主动脉血，离心分离血浆；打开大鼠胸腔分离出完整肺组织和气管，用止血钳夹住气管和左支气管，在右支气管上方用小剪子切一个小口，使用抽取2 mL预冷PBS溶液自制滴注管插入，用细线系紧，注入右肺后停留30 s后回抽得到右肺肺泡灌洗液，离心取上清；用试剂盒测定每组大鼠血浆与肺泡灌洗液中的TNF-α、IgG、IgM和GLO。将大鼠左肺置于组织固定液12 h后，石蜡包埋切片，HE染色。

1.7 统计学方法 采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，各组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织大体观察 空白组和对照组大鼠肺组织呈现正常血肉色，滑嫩柔软且有弹性，无明显异常现象；模型组大鼠肺组织则相对变硬，暗色存于表面，且还存在较大的黑色斑块；灌药组大鼠肺组织虽也呈浅暗红色，其表面却存在部分白色斑块及较为细小的血色小斑点，病变程度低于模型组。（见图1）

图1 各组大鼠肺组织大体形态

2.2 肺组织病理学 与空白组和对照组比较，模型组可见肺泡腔缩小，肺泡局部断裂，肺泡间隔增宽，且有大量的炎性细胞浸润；与模型组比较，灌药组损伤情况较轻，炎细胞浸润较为减轻，肺毛细血管结构较为完整，但仍可见少量出血现象。（见图2）

图2 各组大鼠肺组织石蜡切片图（HE，×400）

2.3各组大鼠肺泡灌洗液和血浆中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比较 对照组大鼠肺泡灌洗液中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；模型组大鼠肺泡灌洗液中IgM、TNF-α、GLO含量明显高于对照组（P<0.05）；灌药组大鼠肺泡灌洗液中IgM、TNF-α、GLO含量明显低于模型组（P<0.05）；各组大鼠肺泡灌洗液中IgG含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠肺泡灌洗液中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比较（±s）

表1 各组大鼠肺泡灌洗液中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比较（±s）

注：与空白组比较，aP>0.05；与对照组比较，bP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）IgM（μg/mL）IgG（μg/mL）TNF-α（pg/mL）GLO（g/L）空白组 10 0 1 348.9±171.3 481.2±53.1 178.29±60.0 11.42±4.07对照组 10 0 1 280.9±155.4a 486.0±53.3a 197.82±46.4a 10.16±3.44a模型组 10 0 1 557.1±130.5b 513.4±39.9 319.47±56.7b 23.67±5.31b灌药组 10 2.7 1 319.1±83.7c 511.4±39.2 203.95±45.1c 16.36±3.87c

对照组大鼠血浆中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；模型组和灌药组大鼠血浆中IgM、TNF-α含量明显高于对照组（P<0.05），灌药组大鼠血浆中IgM、TNF-α含量与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；各组大鼠血浆中IgG、GLO含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血浆中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比较（±s）

表2 各组大鼠血浆中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比较（±s）

注：与空白组比较，aP>0.05；与对照组比较，bP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）IgM（μg/mL）IgG（μg/mL）TNF-α（pg/mL）GLO（g/L）空白组 10 0 1 127.6±91.2 392.6±33.5 503.50±44.2 39.23±9.62对照组 10 0 1 130.6±61.1a 411.0±23.4a 506.58±61.3a 39.01±9.47a模型组 10 0 1 570.3±137.0b 418.0±20.6 707.93±65.4b 42.84±7.48灌药组 10 2.7 1 468.7±193.8b 413.4±15.3 643.48±71.0b 40.22±6.32

3 讨 论

PM2.5作为空气质量监测的重要指标，对人类呼吸系统的损伤尤为直接与严重，大量流行病学研究显示PM2.5长期暴露会明显增加肺部疾病的发病风险，包括肺炎、哮喘、COPD、尘肺、肺癌、肺纤维化和间皮瘤等[9]。在中医学上，雾霾集燥、湿、毒邪于一体，治疗上强调“未病先防，既病防变”，辨证论治[10]，雾霾引起的肺部炎症可用清肺、润肺的中药，如罗汉果、玉竹、芦根、余甘子、百合、陈皮等具有抗菌及调节免疫的作用。甘草具有解毒功效。以上中药结合健脾中药如陈皮、薏苡仁等组合而成的中药茶可用于雾霾的防护研究。

本实验选用SD大鼠，通过非损伤性气管滴注的方法来进行PM2.5雾霾颗粒染毒处理，从实验结果中可以看出，对照组与空白组比较，无明显差异，说明实验操作对大鼠无明显影响，而模型组无论是大鼠肺组织大体观察、HE染色镜下观察，还是肺泡灌洗液和血浆中的IgM、TNF-α含量及肺泡灌洗液中GLO含量，与对照组比较，均有明显的差异，表明PM2.5雾霾颗粒会引起大鼠肺部病理损伤，且让肺泡灌洗液和血浆中TNF-α和IgM以及肺泡灌洗液中的GLO分泌增加，而IgG并没有明显变化。

TNF-α是一类主要由活化单核巨噬细胞产生，在炎症反应的起始阶段释放的促炎性细胞因子，PM2.5雾霾颗粒引起其分泌增加，这与李美珍等[11]研究结果一致。PM2.5的直径较小，可避开人体内纤毛的滤过作用，随着呼吸而直接进入到呼吸道深部，与肺内的细胞进行直接的接触，引起的氧化应激和炎症反应在肺部疾病中起关键作用[12]。而PM2.5引起机体炎症反应机制复杂，与支气管上皮细胞[13]、肺巨噬细胞[14-15]、血管内皮细胞[16]等相关，其导致炎症因子（如TNF-α等）的异常分泌。此外，众多细胞因子还参与B细胞的活化，促使体液免疫应答的产生，引起全身炎症反应，导致组织和器官的免疫损伤。

PM2.5雾霾颗粒除了导致细胞因子的异常分泌外，还可导致免疫球蛋白的变化。PM2.5雾霾颗粒可导致SIgA[17]上升，以及哮喘患者IgE[18]的分泌增加。ZHAO J等[19]在研究交警暴露于PM2.5对全身免疫和炎症反应的生物学影响时发现，暴露于PM2.5后IgM、IgG和IgE增加且IgA和CD8 T细胞减少，这表明体液免疫被激活但是细胞免疫可能被抑制。本实验结果发现PM2.5雾霾颗粒可引起大鼠肺损伤模型肺泡灌洗液中球蛋白的增高，IgM分泌增加，而IgG并没有明显变化，原因可能是短期内PM2.5雾霾颗粒的暴露引起了早期体液免疫应答，以IgM升高为主。

此外，LENDAK D F等[20]认为TNF-α超家族成员是B细胞稳态的主要调节因子，其中B细胞活化因子（BAFF）是免疫球蛋白产生的主要诱导剂，其与IgM浓度呈正相关。本实验结果表明，与模型组比较，灌药组大鼠肺组织损伤较模型组轻微，病理切片中炎细胞浸润、肺泡间隔增宽等现象明显改善，且肺泡灌洗液中的IgM、TNF-α含量明显降低，说明霾黄金中药茶可在一定程度上缓解PM2.5引起的免疫性炎症因子的分泌和体液免疫应答反应，其机制可能是降低TNF-α，调节BAFF，降低IgM，从而下调体液免疫应答引起的炎症反应。在接下来的实验中将进一步探讨具体机制，包括PM2.5对BAFF因子水平的影响，以及上升的IgM主要来源。