东莞地区耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的产酶情况及耐药性分析

庞彩莲，刘敏娟，林景涛，陈凯妮，黄嘉莹，吴品，周正维，许艳茹

东莞市大朗医院检验科，广东 东莞 523770

铜绿假单胞菌(PAE)是临床上常见非发酵病原菌，也是当前多重耐药菌较为难治的病原菌之一，近年来由于亚胺培南等碳青霉烯类抗生素的广泛应用，PAE产生了碳青霉烯酶，给临床抗感染治疗造成极大困难[1]。本研究收集东莞地区感染标本中分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)进行耐药分析及碳青霉烯酶表型检测，为临床合理用药及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集2018年1月至2021年6月东莞地区二、三级综合性医院在临床标本中分离的CRPA共216株，其中痰标本139株，腹腔脓液17株，肺泡灌洗液30株，伤口分泌物12株，尿液10株，胸水3株，血液5株，收集菌株为患者的第一株菌株，剔除重复株。

1.2 试剂和设备 血平板、麦康凯平板、M-H琼脂平板、OXOID药敏纸片(江门凯林有限公司)，VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定仪、比浊仪、GN鉴定卡、GN09药敏卡等法国生物梅里埃原装配套产品(广州华鑫公司)，亚胺培南缓冲液(上海科原实业发展有限公司)。

1.3 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853均来自广东省临床检验中心。

1.4 菌株鉴定及药敏试验 取已分纯新鲜培养的平板上细菌，用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至0.5个麦氏单位，使用法国生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定仪和GN卡、GN09卡进行菌株鉴定及药敏试验。

1.5 PAE产碳青霉烯酶及其表型检测 采用2017年CLSI推荐的eCIM试验检测CRPA是否产碳青霉烯酶[2-3]。取10μL纯菌落于2 mL胰蛋白胨大豆(TSB)肉汤中，放入含10μg美罗培南的无菌纸片，35℃孵育4 h±15 min，制备0.5麦氏浊度的大肠埃希ATCC25922菌悬液，将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出，贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MH琼脂(MHA)平板上，35℃孵育过夜后，量取抑菌圈直径，美罗培南抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm但抑菌圈内有散在菌落，判断碳青霉烯酶阳性。碳青霉烯酶表型检测[4]：采用纸片扩散法，严格按照药物敏感性实验流程及厂家说明书上操作，制备细菌悬液浓度为0.5麦氏单位，均匀涂布于MHA平板上，张贴4张亚胺培南(10μg/片)药敏纸片，纸片中心距离≥25 mm，在其中三张纸片上分别滴加10μL EDTA溶液(0.5 mol/L)、10μL 3-氨基苯硼酸溶液(40 mg/mL)、10μL EDTA溶液(0.5 mol/L)+10μL 3-氨基苯硼酸溶液(40 mg/mL)，35℃培养过夜后判读结果。判定指标为若含EDTA溶液抑制剂的亚胺培南抑菌圈直径与单药相差≥5 mm以上，则可判断该菌株产生金属β内酰胺酶，若含3-氨基苯硼酸抑制剂的亚胺培南抑菌圈直径与单药相差≥5 mm以上，则可判断该菌株产丝氨酸酶。

1.6 统计学方法 采用WHONET5.6和SPSS17.0软件进行数据统计分析。

2 结果

2.1 菌株来源 216株CRPA菌株标本分布以痰标本为主，其中以痰液和肺泡灌洗液最多13.89%，见表1。

表1 216株CRPA菌株标本来源分布及构成比

2.2 CRPA产碳青霉烯酶检测结果 216株CRPA中产碳青霉烯酶83株，占38.4%(83/216)，其中产丝氨酸酶38株，占17.6%(38/216)，产金属酶30株，占13.9%(30/216)，同时产丝氨酸酶+金属酶15株，占6.9%(15/216)，不产碳青霉烯酶133株，占61.6%(133/216)。

2.3 CRPA的药敏结果 216株CRPA的药敏结果显示，亚胺培南和美罗培南耐药率分别为96.1%和72.6%，氨曲南耐药率为50.9%，其他药物耐药率均在40%以下，见表2。

表2 216株CRPA的药敏结果(%)

3 讨论

碳青霉烯类抗生素是目前临床上常用且有效的抗铜绿假单胞菌药物，耐药率也在不断上升。很多报道PAE耐药率上升与产酶有关[5-6]；朱蓓伟等[7]还报道，PAE的耐药机制主要为外膜蛋白Opr-D2缺失和产SPM型金属酶。东莞地区216株CRPA碳青霉烯酶表型检测结果显示，产碳青霉烯酶共83株，占38.4%，其中产丝氨酸酶38株，占17.6%，产金属酶(MBLs)30株，占13.9%，同时产丝氨酸酶+金属酶15株，占6.9%，不产碳青霉烯酶133株，占61.6%。因此，本实验中产MBLs只是PAE对碳青霉烯类耐药的机制之一，不是对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制，与刘涛等[8]报道相似。这可能是因为PAE固有耐药性、外膜蛋白Opr-D2缺失、非特异外排泵高表达作用、外膜通透性降低等导致细菌耐药；其次，不合理抗菌药物使用包括临床抗菌药物滥用、患者未遵从医嘱或未按疗程规范使用抗菌药物，以及在农牧业和鱼类饲养过程中大量使含有抗菌药物饲料等情况；医疗机构感染预防与控制措施不当，导致交叉传播，产生更多的耐药菌株[9]。

本研究中，菌株来源分布主要以痰标本为主，占64.35%，其次为肺泡灌洗液和伤口分泌物，无菌体液如胸水和血液比例相对较低。216株CRPA的药敏结果显示，亚胺培南和美罗培南耐药率分别为96.1%和72.6%，耐药率在50%～70%的有氨曲南，耐药率在30%～50%的有哌拉西林、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、环丙沙星，耐药率在30%以下的有哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、左旋氧氧沙星。与曾婷等[10]报道的除哌拉西林/他唑巴坦的耐药率最低为50.53%外、其他的耐药率均≥60%有差异。在CRPA中敏感性最好的是氨基糖苷类和阿米卡星，其次为庆大霉素和妥布霉素，敏感性均为75%以上，与王琼琼等[11]、张艳芳等[12]报道相近，因此，在用药时首选耐药率在30%以下的药物。

据万永艳[13]报道，碳青霉烯类抗菌药物的使用量与PAE对美罗培南、亚胺培南的耐药率呈正相关。因此，临床应综合考虑感染菌的耐药表型和药敏结果，合理选择抗菌药物，强化碳青酶烯类抗菌药物临床应用的监督管理[14]，对MBLs阳性的感染菌，即使亚胺培南体外药敏结果敏感，临床也应慎用，对碳青霉烯类耐药将意味着同时对多种抗菌药物耐药。

(志谢：东莞市人民医院、东华医院及兄弟单位提供菌株。)