EDNRB在前列腺癌中的表达及临床预后意义

李菲，王宇航，徐陈晨，张永静，李伟玉，陆进

(1. 蚌埠医学院临床医学院，安徽 蚌埠 233030；2. 蚌埠医学院人体解剖学教研室，安徽 蚌埠 233030；3. 蚌埠医学院数字医学与智慧健康安徽省重点实验室，安徽 蚌埠 233030)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是最常见影响男性健康的一种恶性生殖系统肿瘤，是全球范围内男性癌症中的第二大死因[1]。截至2017年，美国前列腺癌的确诊病例超19万余，死亡病例超3.3万余人[2]。在中国前列腺癌的发病率较西方国家低，但是由于生活方式改变等原因，近年来开始呈现明显的上升趋势[3]。前列腺癌病因复杂，目前未被完全阐明，但遗传因素和基因改变目前被认为是其最关键的风险因素[4]。近些年来，利用生物信息学分析癌症发生发展过程中出现的遗传或表观遗传学改变，并寻找与癌症诊断和预后相关的生物标志物是一种新的方法[5]。本研究通过生物信息挖掘技术，利用多个数据库进行数据分析，来挖掘前列腺癌潜在的生物标记物，为其诊断治疗提供新的策略。

1 资料与方法

1.1 数据来源 GEO 数据库( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 是一个包含了高通量基因表达数据集、基因芯片和微阵列的数据库。从GEO数据库中筛选并下载4组前列腺癌数据集 GSE3325[6]、GSE46602[7]、GSE55945[8]、GSE69223[9]，见表1。

表1 数据集具体信息

1.2 差异表达基因的筛选 利用 GEO2R对4组前列腺癌(PCa)数据进行分析，并通过绘制韦恩图筛选PCa的差异表达基因(DEGs)，筛选标准为P<0.01且|log2FC|≥1，去除没有对应基因符号的探针组或同一基因对应多个探针等情况。

1.3 GO和KEGG富集分析 DAVID数据库( https：//david.ncifcrf.gov/) 中包括生物数据和分析工具，可以提供基因和蛋白质信息注释功能。基因本体论 (Gene Ontology，GO)功能注释是一种分析注释基因生物学过程的生物信息学工具。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析是一个从分子水平来了解生物系统高级功能的数据库。利用DAVID对DEGs进行GO和KEGG富集分析，筛选条件：P<0.05且Count≥5。

1.4 蛋白互作网络及关键基因筛选 STRING数据库(http：//string-db.org)可以用来预测蛋白质-蛋白质相互作用关系(protein-protein interactions，PPI)。利用STRING数据库对DEGs进行PPI网络分析，并将数据导入Cytoscape软件中，利用Cytoscape中的Cytohubba插件的EPC算法计算得分前10的基因作为关键基因。

1.5 关键基因的表达与生存预后分析 基因表达谱动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)是一种成熟的可以用于分析RNA测序表达数据的网页工具。通过GEPIA分析关键基因在前列腺癌组织以及正常前列腺组织中的预后和表达情况。人类蛋白图谱数据库(Human Protein Atlas，HPA)是一种从RNA和蛋白水平研究人类不同组织和器官中的蛋白表达情况的网页工具。通过HPA下载TCGA数据作图验证GEPIA的分析结果。

2 结果

2.1 筛选差异表达基因 对4组数据集以P<0.01且|log2FC|≥1为条件处理后，进行火山图和韦恩图绘制，获得4组公共数据共有的103个差异表达基因，其中上调基因34个，下调基因69个(见图1、图2)。

图1 火山图

图2 韦恩图

2.2 GO功能注释和KEGG通路富集分析 使用DAVID数据库对103个DEGs进行GO和KEGG富集分析(见表2)。GO 分析显示，DEGs的细胞学过程(biological processes，BP)主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录负调控、血管生成、脂质代谢、细胞分化过程等；分子功能(molecular function，MF)主要包括蛋白质异二聚体活性等；细胞成分(cell component，CC)主要包括细胞外基质、细胞质的核外区域、质膜等相关。KEGG 通路分析显示差异基因主要与局部黏附性、Hippo信号通路显著相关。

表2 差异基因的GO分析和KEGG分析

2.3 构建PPI网络筛选关键基因 利用STRING数据库对103个DEGs进行分析(见图3)，通过Cytoscape软件的Cytohubba插件的EPC算法筛选，得到CAV1、SNAI2、TGFB3、CAV2、PGR、MYOF、EHD2、FGFR2、EDNRB、PRKG110个关键基因(见图4)。

图3 PPI网络

图4 关键基因

2.4 表达与生存分析结果和验证 10个关键基因在患者体内均为低表达，仅有EDNRB与患者的预后显著相关，且其低表达不利于PCa患者的总生存期(overall survival，OS)(P<0.05)，见图5。根据HPA里下载的TCGA数据所作图验证EDNRB确在患者体内低表达且与预后有一定的相关性，见图6。

图6 HPA验证

3 讨论

有研究表明中国2005—2014年全国男性前列腺癌标化发病率上升39.65%，城市发病率高于农村[10]，在1992—2017 年间前列腺癌死亡率整体呈上升趋势，粗死亡率(1/100 000)从1992的3.39上升至2017的7.17[11]。前列腺癌与男性健康息息相关，而且由于其发病率和死亡率快速增加，预后较差，因此，应做好前列腺癌的筛查与预防。但早期前列腺癌同其他前列腺疾病诊断区分困难，前列腺癌防治仍是当今中国乃至全世界的公共卫生所要面临的重大难题。

注：A：CAV1，B：SNAI2，C：TGFB3，D：CAV2，E：PGR，F：MYOF，G：EHD2，H：FGFR2，I：EDNRB，J：PRKG1。

中国抗癌协会发布的中国前列腺癌患者基因检测专家共识(2019年版)[12]中积极倡导组建生殖泌尿肿瘤精准医学专家团队(genitourinary molecular tumor board，GU-MTB)，设计精准化诊疗方案，建立由生物标志物引导的临床治疗路径，从而为其治疗提供更多选择。因此，从肿瘤大数据中筛查前列腺癌的关键基因，对其预防与治疗具有重要的意义。

本次研究共筛选出103个DEGs，包括34个下调基因和69个上调基因。通过GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在血管生成、脂质代谢等过程中，与Hippo信号等通路显著相关。早在1976年就有研究证明血管生成与肿瘤的进展关系紧密，尤其是与肿瘤细胞的增殖和转移有关[13]。脂质代谢在肿瘤进展和转移侵袭等过程中也起到重要作用[14]。目前已经有研究[15-16]证实Hippo信号通路在肿瘤的发生发展中起关键作用，并且随着对 Hippo信号通路的深入研究，发现其与心血管系统、免疫系统和其他系统也有重要关系。当Hippo信号通路发生了突变或者异常时，YAP/TAZ开始过度表达且聚集在核中，其促进细胞增殖能力被激活，从而促进肿瘤发生发展。本研究发现EDNRB(内皮素受体B， endothelin receptor type B)基因的高表达患者生存率高于低表达患者，显示与前列腺癌的预后有意义。EDNRB是一种内皮素受体相关抑癌基因，参与介导细胞信号转导，其启动子区发生甲基化而抑制其表达导致了肿瘤的发生[17]。内皮素B受体可以通过促进细胞凋亡和清除ET-1来对抗肿瘤的进展[18]。李志标等[19]的研究也表明EDNRB与前列腺癌患者的生存率密切相关。同国内外研究对比，此次筛选出来的关键基因EDNRB与前列腺癌的发生发展过程确实有相关意义，有研究应用的意义。

综上所述，本研究利用多个数据库结合生物信息学技术综合分析，发现EDNRB 这个关键基因与前列腺癌的预后相关，可能会为寻找前列腺癌潜在的生物标志物和研究其生物学机制提供一些有用的信息和方向，使后续进行的基础验证和临床研究更具有针对性，从而可以避免盲目的实验并且减少科研资源的浪费。但是生物信息学分析因为数据量、准确率等原因导致结果总会有一定的瑕疵，其结论最终均需要大量的实验和临床数据来验证。