程厚之,张丽凤,梁祚仁,廖素婵,李艳丽,莫颂轶,黄彦峰,余双全,黄俊杰
(右江民族医学院基础医学院,广西 百色 533000)
在日常生活中铝可以通过水、食物等途径进入体内在肝、脑等组织中蓄积,蓄积在机体中的铝可通过多种途径来损害认知功能[1-2]。随着日常生活中铝制品的广泛使用、食品中铝添加剂的应用以及长期职业接触铝等,高铝暴露给人体健康带来的危害呈增多的趋势,寻找有效药物预防和治疗铝中毒具有重要的意义。五味子乙素(Schisandrin B, Sch B)具有抗氧化、抗凋亡、抗衰老等作用[3-4]。本研究旨通过用Sch B干预治疗慢性铝中毒大鼠,检测大鼠学习记忆水平和海马神经细胞凋亡率,探讨Sch B对慢性铝中毒大鼠神经细胞凋亡及学习记忆能力的影响。
1.1 实验动物 60只Wistar大鼠,体重180~200 g,雌雄各半,购买于长沙天勤生物技术有限公司[动物许可证号:SCXK(湘)2019-0014]。
1.2 主要试剂与药品 细胞凋亡试剂盒(南京建成公司);三氯化铝(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);五味子乙素(维克奇生物科技公司);吡拉西坦(广东华南药业集团有限公司)。
1.3 动物分组与给药 按参考文献[5]方法建立慢性铝中毒大鼠模型,用AlCl3浓度为16 g/L的水溶液每天按120 mg/kg剂量拌入饲料中喂养大鼠3个月。大鼠随机分为6个组,每组10只大鼠,即Sch B低剂量组、Sch B中剂量组、Sch B高剂量组及铝中毒模型组、阳性对照组和空白对照组。Sch B低、中、高剂量组用Sch B进行灌胃,各组剂量分别为10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg;阳性对照组用吡拉西坦进行灌胃,剂量为400 mg/kg;各组每天灌胃1次,共30 d。
1.4 Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力 定位航行实验结束24 h后,撤除定位航行训练实验时的水下平台,开始进行空间探索实验,以检测大鼠对平台空间位置的记忆能力。任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠在60 s内第一次跨越平台时间以及跨越平台次数,第一次跨越平台时间即是潜伏期。
1.5 原位细胞凋亡检测法(TUNEL)检测大脑皮层和海马神经细胞凋亡 10%水合氯醛腹腔麻醉后,分别迅速取大鼠大脑皮层和海马,4%多聚甲醛中继续固定24 h。取各组已常规制备好的组织,经石蜡包埋、切片,二甲苯脱蜡及乙醇脱水,蛋白酶 K消化、PBS漂洗,TUNEL反应按试剂盒常规操作,经破膜、室温平衡、取TUNEL试剂盒内适量TDT酶、dUTP、buffer按一定比例混合后覆盖组织、DAPI复染细胞核、封片、镜检。在显微镜下观察,DAPI染出来的细胞核在紫外线的激发下为蓝色,试剂盒为FITC荧光素标记,阳性凋亡细胞核为绿色,每张切片随机选取5个不重复视野观察计数,各组切片选取部位尽量一致。细胞凋亡率=(凋亡细胞/总细胞)×100%。
2.1 Morris水迷宫测试大鼠空间探索实验潜伏期和平台穿越次数 与空白组相比,模型组大鼠空间探索实验潜伏期明显变长,平台穿越次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和Sch B中、高剂量组空间探索实验潜伏期均缩短,平台穿越次数增多,高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 Morris水迷宫空间探索实验潜伏期和平台穿越次数
2.2 TUNEL检测神经细胞凋亡水平 显微镜下观察神经细胞凋亡结果,以细胞核出现荧光绿色染色为TUNEL阳性细胞。神经细胞凋亡率统计结果显示:空白对照组、中毒模型组、阳性对照组和Sch B低、中、高剂量组大脑皮层神经细胞凋亡率分别为(2.90±1.67)%、(8.03±2.34)%、(3.37±1.52)%和(5.20±1.30)%、(3.94±1.33)%、(3.76±1.53)%;海马神经细胞凋亡率分别为(2.54±0.42)%、(18.01±3.19)%、(3.92±0.92)%和(10.52±2.18)%、(5.84±1.91)%、(4.23±1.84)%。其中铝中毒模型组大脑皮层和海马神经细胞凋亡率均较空白对照组明显增多(P<0.01);Sch B中、高剂量组大脑皮层和海马神经细胞凋亡率比铝中毒模型组明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。见图1、图2。
注:A:空白对照组;B:铝中毒模型组;C:阳性对照组; D:Sch B低剂量组;E:Sch B中剂量组;F:Sch B高剂量组。
注:A:空白对照组;B:铝中毒模型组;C:阳性对照组; D:Sch B低剂量组;E:Sch B中剂量组;F:Sch B高剂量组。
随着日常生活中铝制品的广泛使用、食品中铝添加剂的应用以及长期职业接触铝等,长期铝暴露导致铝在体内蓄积并产生毒性,可导致人和动物学习和记忆能力受损,但其发病机制尚未完全明确。铝引起学习记忆障碍的机制可能涉及多个方面,一是铝中毒时大脑皮层和海马神经细胞有不同程度的凋亡,神经细胞凋亡是铝损伤大脑细胞的重要方式,是导致大鼠学习记忆能力障碍的重要因素之一。研究表明[6-7],铝通过多途径影响诱导神经细胞凋亡,如铝通过线粒体膜对细胞凋亡的影响;铝通过脂质过氧化对细胞凋亡的影响;铝通过Bcl-2家族对细胞凋亡的影响;铝通过Caspase家族对细胞凋亡的影响等。二是铝可引起神经细胞死亡,产生神经毒性并最终导致机体学习及认知功能障碍。铝神经毒性作用与神经递质及有关酶的代谢有关,铝对兴奋性氨基酸递质毒性的诱导作用,使神经元发生退行性病变和脑细胞受损,铝可通过增加乙酰胆碱酯酶、抑制胆碱乙酰基转移酶活性,使脑内乙酰胆碱含量减少,一旦脑内铝过量,逐渐损害学习记忆功能[8];铝神经毒性与Wnt信号通路、Notch信号通路及丝裂原活化蛋白激酶途径等信号转导通路有关[9]。Sch B是中药五味子中有效成分,现代研究表明,五味子中含有丰富的木脂素,而Sch B正是五味子木脂素的主要活性成分之一,其具有抗衰老、抗氧化、抗凋亡、改善学习记忆等作用[10-11]。
本实验中,通过建立慢性铝中毒大鼠模型,观察到铝中毒的大鼠学习和记忆能力下降,大脑皮层和海马中神经细胞凋亡增加,提示铝中毒导致学习和记忆能力的损害与神经细胞凋亡增加,这与以往的研究结果一致[12]。本实验发现,在给予Sch B治疗30 d后,大鼠大脑皮层和海马神经细胞凋亡率明显减少,学习和记忆能力显著提高,这表明Sch B 可以显著降低神经细胞凋亡,减轻铝中毒大鼠皮质、海马部位损伤,有效改善铝中毒大鼠的学习和记忆能力。其作用机制是Sch B能够有效增强机体的抗氧化能力,减轻氧化损伤程度,通过增强抗氧化剂活性抑制细胞凋亡,进而对受损神经细胞起到保护作用[13-14];Sch B还可能通过降低大鼠脑组织P53和Bax基因的表达,以及降低细胞质中Cyto C含量和Caspase-9、Caspase-3基因的表达,阻断细胞凋亡通路,从而发挥抑制神经细胞线粒体凋亡,保护受损神经细胞,改善大鼠的记忆能力[15]。其具体的分子机制有待于进一步探讨和研究。