铁死亡相关基因HWOX1 在骨关节炎软骨中的初步研究*

顾思源，陈 晔，施晓健，王友华*

（1 南通大学附属医院骨科，南通 226001；2 南通大学附属海门医院骨科）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退行性变、软骨骨化以及继发性骨质增生为特征的慢性疾病[1-2]。OA 最常累及膝关节,导致关节严重畸形、关节功能障碍,严重者可致残,直接影响中老年人的生活质量[1，3]。OA 发病机制复杂,炎症因子、代谢等因素均与OA 密切相关。软骨细胞作为软骨的唯一细胞成分,是OA 发生发展过程中主要累及的细胞损伤类型。研究[4]表明,软骨细胞损伤可分为细胞坏死、凋亡和自噬细胞死亡等方式。2012 年,S.J.DIXON 等[5]首次报道了一种新的细胞调控死亡形式,它在形态、生化和基因上都不同于其他形式的细胞死亡,并将其命名为铁死亡。铁死亡是一种铁依赖的非凋亡性细胞死亡,其特征是抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4 失活和脂质活性氧积累。迄今为止,铁死亡被证实与许多退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肾脏变性）、癌变、脑出血、创伤性脑损伤、缺血再灌注损伤和脑卒中有关[6]。然而,目前关于铁死亡在OA 进展中的研究甚少。本研究利用生物信息学挖掘有效的GEO 数据,筛选出OA 和正常志愿者软骨组织差异mRNA,并利用软件对高表达的差异基因做京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析,筛选出铁死亡相关的差异基因；然后利用正常膝关节软骨标本,中期、晚期OA 患者软骨标本验证上述铁死亡相关差异基因血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HWOX1）的表达。HWOX1 是血红素分解代谢的一种必需酶,在铁死亡中扮演着双重作用。一方面,作为细胞保护酶,能显著减轻erastin 诱导的肾上皮细胞铁死亡[7]；另一方面,高表达的HWOX1 可诱导乳腺癌细胞、骨肉瘤细胞等发生铁死亡[8-9]。然而,关于HWOX1 在OA 软骨细胞及组织中的表达研究较少。本研究将有助于从铁死亡的角度为OA 的发病机制提供更多理论依据。

1 对象和方法

1.1 GEO 芯片数据检索与分析 在美国国立生物技术信息中心（NCBI）平台下的基因表达综合数据库GEO（http://www.ncbi.nlm.gov/geo/）中,检索含有OA软骨组织的基因表达数据,选取并下载GSE114007 的基因表达数据[10]。GSE114007 信息:GPL11154 Illumina HiSeq 2000 以及Illumina NextSeq 500 高通量测序平台,包含8 例正常人及10 例OA 患者关节软骨组织的mRNA 表达阵列数据。下载数据为count值表达矩阵,用R（v3.6.1）语言DESeq2（v1.25.16）包以log（FC）绝对值＞1,P<0.05 为标准,对mRNA-seq 数据进行差异基因分析。

1.2 基因功能富集和注释 为阐明差异基因参与的生物学进程,利用WebGestalt 网站（http://www.webgestalt.org）对差异基因进行KEGG 通路富集分析,寻找差异表达基因所富集的关键通路。

1.3 Western Blot 所用6 例OA 患者关节软骨来自膝关节置换术且符合OA 分期,3 例正常关节软骨样本来自截肢的正常膝关节。本研究得到了南通大学附属海门医院医学伦理委员会的批准。将所得软骨组织剪碎,液氮中研磨并加入蛋白裂解液充分裂解蛋白,离心后取上清。BCA 蛋白浓度检测法测定蛋白浓度,配制聚丙烯酰胺凝胶,电泳分离蛋白样品,接着,在标准湿式转膜装置中进行转膜。孵育1∶1 000 的抗HWOX1 的兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology，WA，USA）,4 ℃过夜。室温中孵育抗兔IgG 2 h,手动X 感光胶片显影。

1.4 统计学方法 使用SPSS 17.0 以及Graphpad prism 6 软件对数据进行统计分析。计量资料以表示,组内比较采用配对t 检验,组间比较采用独立样本t 检验。实验结果重复3 次以上,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GEO 数据检索、预处理及OA 患者关节软骨组织差异基因分析 GSE114007 的软骨组织mRNAseq 表达矩阵分析结果显示,OA 患者与正常人关节软骨组织共有2 694 个差异基因,其中1 304 个基因在OA 患者软骨组织中高表达,1 390 个基因低表达（图1A）。KEGG 富集分析结果显示,高表达基因显著富集在细胞黏附、矿物质吸收、细胞铁死亡等通路（图1B）。

图1 OA 患者与正常人关节软骨组织差异基因分析

2.2 正常人与OA 患者关节软骨组织中高表达的铁死亡相关基因比较 OA 患者高表达的基因中,有7个与铁死亡相关（表1）。

表1 正常人与OA 患者关节软骨中高表达的铁死亡相关基因mRNA-seq 均值的比较

2.3 OA 患者与正常人关节软骨组织中HWOX1 蛋白的表达结果 HWOX1 在中期及晚期OA 患者软骨标本中表达增高,晚期显著高表达,而正常膝关节软骨标本中低表达。HWOX1表达随OA 病程严重程度的增加而升高（图2）。

图2 OA 患者与正常人关节软骨组织中HWOX1 蛋白表达验证

3 讨 论

OA 是最常见的关节疾病,发病率呈逐年上升趋势。既往研究[4]表明,软骨细胞坏死、凋亡和自噬细胞死亡是OA 发生的重要原因。因此,抑制铁死亡是一种新颖而有前景的治疗方法。然而,铁死亡是否与OA 进展相关目前还不清楚,参与铁死亡的相关基因是否在OA 中表达异常也缺乏研究。

本研究利用生物信息学技术挖掘GEO 数据库中的GSE114007 数据,筛选出OA 和正常人软骨组织差异表达的mRNA。利用软件对高表达的差异基因进行富集分析,筛选出铁死亡相关的差异基因。通过进一步验证,明确铁死亡相关基因HWOX1 在中期、特别是晚期OA 患者软骨标本中表达显著增高,在OA 发生发展中可能发挥重要作用。

通过分析GSE114007 芯片数据发现,OA 和正常人软骨组织具有不同的mRNA 表达模式,两组之间共存在2 694 个差异基因,其中1 304 个基因在OA 患者软骨组织中高表达,1 390 个基因低表达。提示这些异常表达的mRNA 可能参与并促进OA 的临床进展。通过对差异表达的基因做KEGG 富集分析,进一步阐明铁死亡相关基因HWOX1 在OA 患者软骨组织中高表达。HWOX1 由于在铁死亡中扮演“促进”与“抑制”的双重作用而受到关注[7-9，11]。本研究表明,HWOX1 表达随OA 病程严重程度的增加而升高,可能参与OA 的病程进展。