干扰LncRNA MLK7-AS1对宫颈癌顺铂耐药细胞增殖及凋亡的影响

杨 筱,陈 颖,乔志远,张艳荣

(1.郑州工业应用技术学院，郑州 451100;2.商洛学院，商洛 726000;3.河南大学第一附属医院，开封 475000)

宫颈癌是临床常见的一种恶性肿瘤，长链非编码RNA(LncRNA)在宫颈癌中表达上调/下调，其序列上存在多种微小RNA(miRNA)的结合位点，其可调控miRNA的表达而间接调节其靶基因表达，LncRNA MALAT1通过激活PI3K/Akt途径促进宫颈癌的顺铂耐药性[1-2]。沉默LncRNA ZFAS1可抑制宫颈癌增殖、迁移和侵袭进而增强顺铂敏感性[3]。LncRNA UCA1还可能作为宫颈癌治疗的潜在靶标[4]。LncRNA MLK7-AS1在卵巢癌中表达水平升高，并可通过调节miR-375/YAP1轴促进卵巢癌的发展[5]。但MLK7-AS1对宫颈癌顺铂耐药的影响及其可能作用机制尚未阐明。靶基因预测显示微小RNA-143(miR-143)与MLK7-AS1存在结合位点，研究表明，miR-143通过抑制MYO6而抑制胃癌细胞的转移[6]。但MLK7-AS1与miR-143可否介导宫颈癌顺铂耐药过程尚未可知。本研究采用低浓度加量持续诱导法建立宫颈癌顺铂耐药细胞，探讨MLK7-AS1与miR-143在宫颈癌顺铂耐药细胞中的表达及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人宫颈癌细胞SiHa、正常宫颈细胞ECT1/E6E7购自美国ATCC细胞库；DMEM培养液、胎牛血清购自上海玉博生物；Lipofectamine2000、凋亡检测试剂盒、MTT试剂、Trizol试剂购自北京索莱宝；反转录与荧光定量PCR检测试剂购自北京天根；顺铂(cDDP)购自上海懋康生物；si-NC、si-MLK7-AS1、miR-NC、miR-143 mimics、miR-143 inhibitor及其阴性对照(NC)购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 采用低浓度加量持续诱导法建立宫颈癌顺铂耐药细胞SiHa/cDDP[7]：用0.1μg/mL顺铂处理宫颈癌细胞SiHa 14d，用0.5μg/mL顺铂处理SiHa细胞6周，用1μg/mL顺铂处理SiHa细胞12周，后续分别使用2μg/mL、4μg/mL顺铂处理SiHa细胞8周、12周，通过40周的诱导SiHa细胞可在含顺铂的培养液(4μg/mL)中稳定生长，并可正常传代，成功建立宫颈癌顺铂耐药细胞SiHa/cDDP。

ECT1/E6E7细胞、SiHa细胞、SiHa/cDDP细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素与100μg/mL链霉素的DMEM培养液中，其中SiHa/cDDP细胞加终浓度为4μg/mL的顺铂维持其耐药性。取对数生长期SiHa/cDDP细胞接种于6孔板(5×104细胞/孔)，待细胞生长融合度达70%时，分别取si-NC、si-MLK7-AS1、si-MLK7-AS1+NC、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor(各100pmol)与脂质体充分混匀，室温孵育30min，使用不含血清的培养液稀释细胞及脂质体，分别将细胞加至脂质体中，转染6h，将培养液更换为DMEM新鲜培养液，加含顺铂的培养液(4μg/mL)继续培养48h，分别记为si-NC组、si-MLK7-AS1组、si-MLK7-AS1+NC组、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor组。

1.2.2 MTT法检测不同浓度顺铂处理细胞后细胞存活率 SiHa细胞、SiHa/cDDP细胞接种于96孔板(3×104细胞/孔)，分别使用不同剂量的顺铂处理细胞，分别记为cDDP 0μg/mL组、cDDP 0.5μg/mL组、cDDP 1.0μg/mL组、cDDP 1.5μg/mL组、cDDP 2.0 μg/mL组，继续培养24h，加MTT溶液(20μL/孔)，于恒温培养箱内继续孵育4h，弃上清，加DMSO(150μL/孔)，室温避光孵育5min，检测各孔光密度值(OD490nm)，细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.3 qRT-PCR检测细胞中MLK7-AS1、miR-143表达水平 采用Trizol法提取细胞中总RNA，用反转录试剂将总RNA合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，按试剂盒说明书操作，采用2-ΔΔCt法计算MLK7-AS1、miR-143相对表达量。

1.2.4 平板克隆形成实验 取各组SiHa/cDDP细胞接种于6孔板(5×104细胞/孔)，培养14d，弃培养液，采用预冷PBS洗涤细胞，加甲醇(500μL/孔)孵育20min，弃甲醇，加400μL结晶紫染色液(1%)孵育15min，晾干后观察克隆形成细胞数。

1.2.5 MTT检测细胞增殖 取si-NC组、si-MLK7-AS1组、si-MLK7-AS1+NC组、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor组SiHa/cDDP细胞接种于96孔板(3×104细胞/孔)，于37℃、体积分数5%CO2培养箱培养24h，加MTT溶液(20μL/孔)，培养4h，弃上清，将DMSO加至96孔板(150μL/孔)，室温避光孵育5min，检测各孔OD值并计算细胞存活率。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 取si-NC组、si-MLK7-AS1组、si-MLK7-AS1+NC组、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor组SiHa/cDDP细胞，用预冷PBS洗涤，弃上清，按凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测MLK7-AS1与miR-143的靶向关系 用基因突变技术将结合位点进行突变，构建含有结合位点的突变型载体WT-MLK7-AS1与含有突变位点的突变型载体MUT-MLK7-AS1，分别将miR-NC、miR-143 mimics与WT-MLK7-AS1、MUT-MLK7-AS1共转染入SiHa/cDDP细胞，于37℃、体积分数5%CO2培养箱培养24h，收集细胞并检测荧光素酶活性。

1.2.8 Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达 取si-NC组、si-MLK7-AS1组、si-MLK7-AS1+NC组、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor组SiHa/cDDP细胞，加400μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，取蛋白样品(50μg)进行SDS-PAGE，转膜、封闭，孵育一抗稀释液(Bax稀释比1∶1000，Bcl-2稀释比1∶1000，内参GAPDH稀释比1∶1000)24h(美国CST)，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(1∶5000)1h(美国Abcam)，滴加ECL，应用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结 果

2.1 不同浓度cDDP对SiHa和SiHa/cDDP的影响 用不同浓度顺铂处理后，SiHa细胞存活率明显降低(P<0.05)，且随着浓度的增加而明显降低(P<0.05)；用不同浓度顺铂处理后，SiHa/cDDP细胞存活率明显降低(P<0.05)，但顺铂不同浓度组间细胞存活率下降幅度低于SiHa细胞，见表1。

表1 不同浓度cDDP对SiHa和SiHa/cDDP细胞存活率的影响

2.2 MLK7-AS1和miR-143在SiHa/cDDP细胞中的表达 与ECT1/E6E7细胞比较，SiHa细胞、SiHa/cDDP细胞中MLK7-AS1表达水平升高(P<0.05)，miR-143表达水平降低(P<0.05)；与SiHa细胞比较，SiHa/cDDP细胞中MLK7-AS1表达水平升高(P<0.05)，miR-143表达水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 MLK7-AS1和miR-143在SiHa/cDDP和SiHa和正常宫颈细胞中的表达

2.3 干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP增殖的影响 与si-NC组比较，si-MLK7-AS1组细胞中miR-143表达水平升高(P<0.05)，细胞存活率降低(P<0.05)，克隆形成数减少(P<0.05)，见表3。

表3 干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP增殖的影响

2.4 干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP凋亡的影响 干扰MLK7-AS1表达可明显促进细胞凋亡及Bax蛋白表达，而抑制Bcl-2蛋白表达(P<0.05)，见图1和表4。

图1 干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP凋亡蛋白表达的影响

表4 干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP凋亡的影响

2.5 MLK7-AS1靶向miR-143 LncBase v.2预测显示，MLK7-AS1与miR-143存在结合位点，见图2。miR-143过表达可明显降低WT-MLK7-AS1的荧光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-MLK7-AS1的荧光素酶活性，见表5。

图2 MLK7-AS1靶向miR-143

表5 双荧光素酶报告实验

2.6 抑制miR-143可逆转干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP增殖凋亡的影响 共转染si-MLK7-AS1与miR-143 inhibitor后可明显促进细胞增殖及Bcl-2蛋白表达，并可增强细胞克隆形成能力，抑制细胞凋亡及Bax蛋白表达(P<0.05)，见图3、表6。

图3 抑制miR-143可逆转干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP凋亡蛋白表达的影响1:si-MLK7-AS1+NC;2:si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor

表6 抑制miR-143可逆转干扰MLK7-AS1对SiHa/cDDP增殖凋亡的影响

3 讨 论

宫颈癌的发病率与死亡率逐年上升，手术或化疗可明显提高治疗效果，而患者生活质量降低及顺铂耐药的发生成为亟待解决的问题，因而如何逆转顺铂耐药性成为改善患者预后的关键环节，抑制LncRNA NCK1-AS1可提高宫颈癌对顺铂的敏感性[8]。LncRNA GAS5通过miR-21而充当肿瘤抑制因子，可降低宫颈癌顺铂耐药性[9]。LncRNA HOXD-AS1在宫颈癌顺铂耐药性细胞中表达上调，沉默其表达可增强细胞对顺铂的敏感性[10]。

抑制MLK7-AS1通过表观遗传调控miR-375抑制胃癌的生长[11]。MLK7-AS1通过下调p21表达而促进结直肠癌细胞增殖[12]。MLK7-AS1在胃癌中呈高表达[13]。但MLK7-AS1在宫颈癌中的表达及其可能作用机制尚未阐明。本研究结果显示，MLK7-AS1在宫颈癌细胞中的表达水平高于正常宫颈细胞，且MLK7-AS1在宫颈癌顺铂耐药细胞中的表达水平高于宫颈癌细胞，提示MLK7-AS1可能作为逆转宫颈癌顺铂耐药性的潜在靶标。本研究结果显示，干扰MLK7-AS1表达可明显降低细胞存活率，还可减少克隆形成细胞数，提示干扰MLK7-AS1表达可抑制宫颈癌顺铂耐药细胞增殖。细胞凋亡在肿瘤发生及发展过程中发挥重要作用，Bcl-2在肿瘤中表达上调，其可抑制细胞凋亡，Bax的作用与之相反[14]。本研究结果显示，干扰MLK7-AS1表达可明显提高宫颈癌顺铂耐药细胞凋亡率，促进Bax的表达及抑制Bcl-2的表达，提示干扰MLK7-AS1表达可促进宫颈癌顺铂耐药细胞凋亡。

本研究通过双荧光素酶报告实验证实MLK7-AS1与miR-143存在靶向关系，MLK7-AS1可充当miR-143竞争性内源RNA分子，并可负向调控miR-143表达。LncRNA HOTAIR通过靶向miR-143-3p调节Bcl-2而促进宫颈癌的进展[15]。miR-143/145表达下调可促进肺癌发展[16]。LncRNA PVT1通过调节miR-143/HK2轴促进胆囊癌进展[17]。本研究结果显示，miR-143在宫颈癌细胞中的表达水平低于正常宫颈细胞，且miR-143在宫颈癌顺铂耐药细胞中的表达水平低于宫颈癌细胞，而si-MLK7-AS1与miR-143 inhibitor联合处理宫颈癌顺铂耐药细胞后，细胞存活率升高，克隆形成能力增强，而凋亡率降低，提示抑制miR-143表达可明显逆转干扰MLK7-AS1对宫颈癌顺铂耐药细胞增殖及凋亡的作用。

综上所述，宫颈癌顺铂耐药细胞中MLK7-AS1表达上调，而miR-143表达下调，MLK7-AS1可靶向结合miR-143，并可负向调控miR-143的表达。体外细胞实验证实，干扰MLK7-AS1表达可抑制宫颈癌顺铂耐药细胞增殖及促进细胞凋亡进而增强细胞对顺铂的敏感性，其作用机制与靶向调控miR-143有关。MLK7-AS1/miR-143可能为逆转宫颈癌顺铂耐药的潜在靶标，但关于MLK7-AS1/miR-143如何调控下游靶基因表达及其可能作用机制仍需深入探究。