超高效液相色谱质谱联用法测定虹鳟中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的不确定度

吕芳，张园，赵春晖，李英，高峰，贾晨，宗超，杨静

(北京市水产技术推广站，农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心(北京)，北京 100176)

孔雀石绿(Malachite green,MG)是一种三苯甲烷类染料，对鱼类的水霉病治疗效果十分显著，因而备受养殖户推崇。众多研究证实孔雀石绿具有高毒性、高残留、致突变、致畸及致癌等副作用[1-3]，极易在生物体内蓄积，因此中国在2002年明令禁止孔雀石绿应用于水产养殖中[4-6]。但因其治疗效果好，价格低廉，仍存在非法使用的现象。凭借山区优越的天然条件，北京房山区、怀柔区虹鳟(Oncorhynchusmykiss)类冷水鱼产业发展壮大。为了增强北京地区虹鳟的市场竞争力，有效保障水产品质量安全，需严防禁用药物孔雀石绿的非法使用，推进渔业高质量发展。为避免孔雀石绿不安全因素对大众产生恐慌，消除“谈绿色变”的顾虑，加强对孔雀石绿的监管控制十分重要，而对水产品中孔雀石绿的检测成为质量控制的关键。

目前针对水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)残留量的检测方法主要有薄层色谱法、分光光度法、气质联用法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法等[6-10]。其中液相色谱质谱联用法高效、灵敏、准确，成为定量检测药物残留的有效手段，而检测结果准确性的探讨特别是不确定度尤为重要，直接关系消费者“舌尖上的安全”。

余孔捷等[11]、晁伟杰等[12]、刘柱等[13]及涂凡等[14]分析研究了液相色谱质谱联用法检测孔雀石绿的不确定度来源和影响，而采用超高效液相色谱质谱联用法测定北京特色冷水鱼虹鳟中孔雀石绿及其代谢物残留量的不确定度研究较少。本研究依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》、《化学分析中不确定度的评估指南》以及相关文献研究[15-17]要求，分析在本实验室中利用超高效液相色谱质谱联用法测定虹鳟中孔雀石绿残留量过程不确定度的主要来源和影响程度，为实验室质量控制提供可靠依据。

1 试验与方法

1.1 仪器与药品试剂

Waters XEVO TQ-S超高效液相色谱质谱联用仪(美国沃特世公司)；赛多利斯ME235P电子天平(德国赛多利斯公司)； 200 μL、5 mL移液枪(德国艾本德公司)。

孔雀石绿草酸盐标准品(MG，纯度≥95.8%)，购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；隐色孔雀石绿标准品(LMG，纯度≥99.0%)，购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；孔雀石绿内标标准品(MG-D5，纯度≥99.6%)，购于德国Witega GmbH公司；隐色孔雀石绿内标标准品(LMG-D6，纯度≥99.8%)，购于德国Witega GmbH公司；甲酸：色谱纯，购于美国Thermo Fisher Scientific公司；乙腈(色谱纯)，购于美国Thermo Fisher Scientific公司；超纯水，购于屈臣氏。

1.2 主要溶液配制

孔雀石绿混合标准储备液的配制：准确称取孔雀石绿草酸盐标准品0.013 98 g(精确至0.000 01g)，隐色孔雀石绿标准品0.010 00 g(精确至0.000 01 g)，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成100 mg/L混合标准储备液，-18 ℃冰箱中冷藏，保存6个月。

孔雀石绿混合标准工作液的配制：吸取孔雀石绿混合标准储备液，用乙腈逐级稀释为100 ng/mL溶液，4 ℃冷藏，保存1个月。

1.3 虹鳟中孔雀石绿的提取与测定

虹鳟按照GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[10]进行样品处理，超高效液相色谱串联质谱测定MG、LMG的残留量。空白基质不加内标按样品前处理方法处理，配制一系列标准溶液，进行超高效液相色谱串联质谱分析。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC©BEH C18 1.7 μm， 2.1×50 mm Column；流动相：A相为乙腈(75%)，B相为0.1%甲酸水溶液(25%)；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。

1.5 质谱条件

离子化模式：大气压电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：4.0 kV；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/hr；碰撞气流速：0.15 mL/min；锥孔反吹气流量：150 L/hr；监测方式：多反应监测扫描(MRM)，定性离子及定量离子对、锥孔电压、碰撞能量等质谱条件参数见表1。

表1 孔雀石绿和隐色孔雀石绿质谱条件参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for malachite green and leucomalachite green

2 测量不确定度评定

2.1 数学模型

虹鳟中MG和LMG残留量计算的数学模型见式(1)：

式(1)

2.2 不确定度的来源测量及计算

本研究中的测量不确定度主要来源于：外标标准溶液配制引入的不确定度，内标标准物质加入量引入的不确定度，样品称量引入的不确定度，定容体积引入的不确定度，提取回收率引入的不确定度及液质联用仪校准引入的不确定度。待测组分残留量测量不确定度的来源分析见图1。

图1 待测组分残留量测量不确定度的来源分析图Fig.1 Source analysis chart of uncertainty for component residues detection

标准不确定度的计算见式(2)：

式(2)

相对标准不确定度的计算见式(3)：

式(3)

3 结果与分析

3.1 外标标准溶液配制引入的不确定度

3.1.1 外标标准物质纯度引入的不确定度

由标准物质证书可知，MG的纯度为95.8%，扩展不确定度为2.0%，LMG的纯度为99.0%，扩展不确定度为0.5%，由于标准物质给出的扩展不确定度属正态分布，为B类评定，置信概率p=95%，包含因子k=2，标准不确定度和相对标准不确定度分别为：MG标准不确定度uP1和相对标准不确定度u1rel分别为1.0和0.010 4；LMG标准不确定度up2和相对标准不确定度u2rel分别为0.25和0.002 5。

3.1.2 外标标准物质称量引入的不确定度

称取MG标准品质量为13.98 mg，LMG标准品质量为10.00 mg，所用称量天平的分度值为0.1 mg，扩展不确定度为0.05 mg，包含因子为k=2，称量标准不确定度umx为0.025 mg，MG相对标准不确定度umlrel和LMG相对标准不确定度um2rel分别为0.001 8和0.002 5。

3.1.3 外标标准溶液定容引入的不确定度

按检定证书给出100 mL容量瓶(A级)容量允差为±0.10 mL，包含因子为k=2，不确定度u3为0.05 mL，相对标准不确定度u3rel为0.000 5。

容量瓶在不同的温度条件下由于体积改变会引起一定的变化，但该变化很小，故其不确定度可忽略。

3.1.4 外标标准溶液稀释引入的不确定度

用1 mL移液管、10 mL移液管和100 mL容量瓶将外标标准储备液逐级稀释，期间使用1次1 mL移液管、1次10 mL移液管和2次100 mL容量瓶，稀释过程中引入的不确定度如下：

1 mL移液管(B级)检定证书给出容量允差为±0. 015 mL，包含因子为k=2，移取1 mL引入的标准不确定度u4为0.007 5 mL，相对标准不确定度u4rel为0.007 5。

100 mL容量瓶(A级)检定证书给出容量允差为±0.10 mL，包含因子为k=2，其引入的标准不确定度u5为0.05 mL，相对标准不确定度u5rel为0.000 5。

10 mL移液管(B级)检定证书给出容量允差为±0.05 mL，包含因子为k=2，移取10 mL引入的标准不确定度u6为0.025 mL，相对标准不确定度u6rel为0.002 5。

100 mL容量瓶(A级)检定证书给出容量允差为±0.10 mL，包含因子为k=2，其引入的标准不确定度u7为0.05 mL，相对标准不确定度u7rel为0.000 5：

因此，在标准溶液配制过程中MG的合成相对标准不确定度为：

LMG的合成相对标准不确定度为：

3.2 内标标准溶液加入引入的不确定度

3.2.1 内标标准物质纯度引入的不确定度

本研究中MG-D5的纯度为99.7%，扩展不确定度为0.3%，LMG-D6的纯度为99.8%，扩展不确定度为0.2%。标准物质的扩展不确定度属正态分布，按B类进行评定，置信概率p=95%，包含因子k=2，则MG-D5标准不确定度up1*和相对标准不确定度u1rel*分别为0.15和0.001 5；LMG-D6标准不确定度up2*和相对标准不确定度u2rel*分别为0.10和0.001 0。

3.2.2 内标标准物质称量引入的不确定度

称取MG-D5标准品质量为10.00 mg，LMG-D6标准品质量为10.00 mg，所用称量天平按检定证书给出的分度值为0.1 mg，扩展不确定度为0.05 mg，包含因子为k=2，称量标准不确定度um*为0.025 mg。

MG-D5相对标准不确定度um1rel*和LMG-D6相对标准不确定度um2rel*分别为0.002 5和0.002 5。

3.2.3 内标标准溶液定容引入的不确定度

100 mL容量瓶(A级)检定证书给出容量允差为±0.10 mL，包含因子为k=2，标准不确定度u3*为0.05 mL，相对标准不确定度u3rel*为0.000 5。

由于容量瓶在不同的温度条件下体积会引起一定的变化，本实验均在25 ℃环境下进行，则由温度产生的标准不确定度可忽略。

3.2.4 内标标准溶液稀释引入的不确定度

内标标准溶液稀释步骤同外标标准溶液稀释过程。

1 mL移液管(B级)检定证书给出容量允差为±0.015 mL，包含因子为k=2，移取1 mL引入的标准不确定度u4*为0.007 5 mL，相对标准不确定度u4rel*为0.007 5。

100 mL容量瓶(A级)检定证书给出容量允差为±0.10 mL，包含因子为k=2，其引入的标准不确定度u5*为0.05 mL，相对标准不确定度u5rel*为0.000 5。

10 mL移液管(B级)检定证书给出容量允差为±0.05 mL，包含因子为k=2，移取10 mL引入的标准不确定度u6*为0.025 mL，相对标准不确定度u6rel*为0.002 5。

100 mL容量瓶 (A级)检定证书给出容量允差为±0.10 mL，包含因子为k=2，其引入的标准不确定度u7*为0.05 mL，相对标准不确定度u7rel*为0.000 5。

3.2.5 内标标准物质加入体积引入的不确定度

200 μL移液器检定证书给出其容量允差为±0.003 mL，包含因子为k=2，移取200 μL内标引入的标准不确定度u(v*)为0.001 5 mL，相对标准不确定度urel(v*)为0.007 5。

因此，MG-D5加入的合成相对标准不确定度为：

LMG-D6加入的合成相对标准不确定度为：

3.3 样品称量引入的不确定度

利用精度为0.01 g的天平称取5.00 g，其最大容许误差为±0.05 g，包含因子为k=2，标准不确定度u(m)为0.025 g，相对标准不确定度urel(m)为0.005。

3.4 样品液定容引入的不确定度

0.5～5.0 mL移液器检定证书检定给出容量允差为±0.01 mL(k=2)，其标准不确定度u(v)为0.005 mL。

加入定容液的量为2 mL，则其相对标准不确定度urel(v)为0.002 5。

3.5 样品提取回收率引入的不确定度

样品前处理包括溶剂提取、净化等步骤，此过程中引入的不确定度可由加标样品提取回收率引入的不确定度进行评定。

在虹鳟样品中添加2.5 μg/kg的孔雀石绿混合标准工作液，做6个平行样品测定MG、LMG的回收率，加标回收率见表2。

表2 加标回收率Tab.2 The results of standard recovery rates

MG标准不确定度u(1rec)和相对标准不确定度urel(1rec)分别为1.94%和0.019 7；LMG标准不确定度u(2rec)和相对标准不确定度urel(2rec)分别为1.25%和0.011 9。

3.6 液质联用仪校准引入的不确定度

根据北京市计量检测科学研究院出具的仪器校准证书：超高效液相色谱质谱联用仪的不确定度u=2%，包含因子k=2，其相对标准不确定度urel(fQ)为0.01。

3.7 标准不确定度的合成和扩展

3.7.1 孔雀石绿标准不确定度的合成和扩展

孔雀石绿的相对标准不确定度分量见表3。

表3 孔雀石绿的相对标准不确定度分量汇总表Tab.3 Summary of relative standard uncertainty components for malachite green

将上述所得数据代入下面公式得到孔雀石绿的相对合成标准不确定度为：

标准不确定度为：

u(1X)=0.079 6 μg/kg=urel(1X)×
2.5 μg/kg×98.63%

扩展标准不确定度为(k=2)：

U1=k×u(1X)=0.159 2 μg/kg

3.7.2 隐色孔雀石绿标准不确定度的合成和扩展

隐色孔雀石绿的相对标准不确定度分量见表4。

表4 隐色孔雀石绿的相对标准不确定度分量汇总表Tab.4 Summary of relative standard uncertainty components for leucomalachite green

将上述所得数据代入下面公式得到隐色孔雀石绿的相对合成标准不确定度为：

标准不确定度为：

u(2X)=urel(2X)×2.5 μg/kg×105.69%=
0.057 6 μg/kg

扩展标准不确定度为(k=2)：

U2=k×u(2X)=0.115 2 μg/kg

3.8 水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的不确定度报告

在95%置信区间内，取包含因子k=2，孔雀石绿残留量的不确定度报告为：

X1=(2.5×98.63%±0.159 2)μg/kg=
(2.465 8±0.159 2)μg/kg (k=2)

隐色孔雀石绿残留量的不确定度报告为：

X2=(2.5×105.69%±0.115 2)μg/kg=
(2.642 2±0.115 2)μg/kg (k=2)

4 结论

分析上述表3和表4不确定度分量可知，本研究不确定度占较大比例的是由样品提取回收率引入。为了减少检测方法的测量不确定度，应在以后的实验过程中尽量规范实验人员的操作，减小溶剂提取、净化前处理过程以及称量、稀释、定容等过程产生的不确定度，且使用误差比较小的精密仪器，确保检测结果的准确性。