19个X-STR荧光复合扩增体系的法医学应用评估

林添春?杨幸怡?熊晨?李奥成?孙宏钰?刘超

【摘要】目的 評估含有19 个X染色体-短串联重复序列（X-STR）的复合扩增体系在法医学中的应用效果。方法 参照DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）的验证指南，评估了含有19 个X-STR的复合扩增体系的种属特异性、灵敏度、抗抑制剂、精确性、可重复性、一致性、在混合样本与陈旧样本中的检测效果及stutter峰和群体多态性。结果 DNA 模板量在0.25～1.00 ng 时，各基因座分型结果清晰准确，均衡性好、特异性强，混合、陈旧样本均能获得正确的分型结果;检测中国南方汉族共196份无关个体血样，19个X-STR遗传标记共检出151个等位基因，基因频率为0.0037 ～ 0.8439，其中多态性信息量最为丰富的基因座是DXS10135（多肽性信息含量= 0.9173），个体识别能力在男、女性群体中分别为0.9124、0.9894;累积个体识别能力在男性群体中大于0.999 999 999 874，在女性群体中大于0.999 999 999 999;在三联体案件中的累积平均排除概率大于0.999 999 999 298，在二联体中的累积平均排除概率大于0.999 999 500 495。结论 含有19 个X-STR的复合扩增体系分型准确、稳定，满足法医学实践的要求，获得的基因频率等参数可为X-STR检验提供数据支撑。

【关键词】X染色体-短串联重复序列;荧光复合扩增;法医遗传学;验证

Forensic evaluation of 19 X-STR fluorescent multiplex amplification system systems Lin Tianchun， Yang Xingyi， Xiong Chen， Li Aocheng， Sun Hongyu， Liu Chao. Department of Forensic Medicine， Zhongshan Medical College， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510089， China Corresponding author， Sun Hongyu， E-mail： sunhongyu2002@163.com; Liu Chao， E-mail： liuchaogzf@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the forensic performance of 19 X-STR fluorescent amplification system. Method Referring to the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods （SWGDAM）， the detection effect of the specificity， sensitivity， inhibitor resistance， repeatability， compatible consistency， stutter and population polymorphism of the system in the mixed and degraded samples was evaluated. Results When the DNA template was between 0.25 and 1.00 ng， the typing results of each locus were distinctly accurate， well balanced and with strong specificity. Correct typing results could be obtained in both mixed and degraded samples. Blood samples of 196 unrelated Han nationality individuals from southern China were collected， and 151 allele profiles were detected from 19 X-STR loci. The gene frequency was detected between 0.0037 and 0.8439. DXS10135 （PIC = 0.9173） was the most polymorphic locus， with discrimination power （DP） of 0.9124 and 0.9894 for the male and female; The total discrimination power （TDP） was greater than 0.999 999 999 874 in the male. and greater than 0.999 999 999 999 in the female; The mean exclusion chance （MEC） in the DNA triplet was higher than 0.999 999 999 298， and greater than 0.999 999 500 495 in the duo cases. Conclusions The 19 X-STR fluorescent amplification system is distinctly accurate and stable， which can fulfill the requirement of forensic application. The gene frequency and other parameters can be provide data support for X-STR testing.

【Key words】X-Chromosome Short Tandem Repeat; Fluorescent multiplex amplification;Forensic genetics; Validation

常染色体及Y染色体-短串联重复序列（STR）已经常规用于司法鉴定，但是X染色体-STR（X-STR）基因座的应用研究相对较少[1]。X染色体具有独特的遗传特性：母亲可以传递给子女，而父亲仅传递给女儿且该染色体来自女儿的祖母，可作为常染色体多态性分析的重要补充，在复杂亲缘鉴定、男女混合样本检测以及部分伦理犯罪中有特殊的应用价值[2]。本研究选择的MicroreaderTM 19 X-STR复合扩增体系（MRX19），遗传标记均分布在非连锁簇内，遗传标记间的遗传距离相距较远，符合独立遗传，但该复合扩增体系群体多态性报道少，尚未见法医应用评估报道。为此，研究收集了196份无关个体血样，检测了19个X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）及性别基因座，评估了该荧光复合扩增体系的种属特异性、灵敏度、抗抑制剂、精确性、可重复性、一致性与在混合样本、陈旧检材中应用效果及影子峰（Stutter峰）和群体多态性，并优化了扩增条件，现报告如下。

材料与方法

一、样 本

种属特异性实验：选取仓鼠、狗、猴子、鸡、龙猫、猫、牛、猩猩、鸭、羊非人源DNA各0.5 ng，均来源于广州市公安局刑事科学技术研究所的科研积累。

抗抑制剂实验：将不同浓度的法医实践常见的抑制剂[血红素、靛蓝、腐殖酸、乙二胺四乙酸（EDTA）]加入到0.5 ng的9947A中。血红素的浓度梯度为0、75、125、150 μmol/L;靛蓝的浓度梯度为0、750、1500、2000 μmol/L;腐殖酸的浓度梯度为0、5、10、20 ng/μL;EDTA的浓度梯度为0、0.8、1.0、1.2 mmol/L。

男/女混合样本：通过混合标准品2800M和标准品9947A来实现的。分别按照1∶1、1∶4、1∶9、1∶19、19∶1、9∶1、4∶1 和1∶1的比例混合，每份混合样本的DNA总量均为1 ng。

分型一致性、陈旧检材实验的样本：来源于日常检案积累。

群体样本：根据知情同意原则，收集来自广东、广西、湖南及江西省的196份（男性样本123份，女性样本73份）中国南方汉族无关个体的血样。本实验涉及到生物实验等有关设计、实施方案及受试者征集过程符合中山医学院伦理原则（伦理批件号：中山医医伦[2020]第044号）。

二、主要试剂和仪器

主要试剂包括MicroreaderTM 19 X ID 荧光检测试剂盒及相应的QD550内标（购自阅微公司）、AGCUX19 STR荧光检测试剂盒及相应的SIZ-500内标（购自中德美联公司）和BK-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（购自博坤生物科技有限公司）[3]。主要仪器包括BK-TQ-001E 博坤全自动DNA提取工作站、Qubit?2.0 Fluorometer定量儀、ABI 9700型扩增仪、ABI 3500全自动遗传分析仪、ABI 3500XL全自动遗传分析仪和ABI 3130XL全自动遗传分析仪。

三、方 法

1. DNA提取

前述所有样本采用BK-超微量磁珠法DNA提取试剂盒通过BK-TQ-001E全自动工作站提取基因组DNA，模板DNA均使用Qubit?2.0 Fluorometer定量仪进行浓度测定[4]。

2. DNA扩增

参照DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）的验证指南，评估MRX19的种属特异性、灵敏度、抗抑制剂性、精确性、可重复性、一致性与在混合样本、陈旧样本中的检测效果及stutter峰和群体多态性[5]。其中特异性、灵敏度、分型一致性、混合样本、陈旧检材实验均使用25.0 μl体系：PCR反应液10.0 μL，引物混合液5.0 μL，MicroreaderTM Tap DNA PolymeraseⅡ 0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，扩增水8.5 μL。PCR扩增使用ABI 9700型扩增仪，扩增循环参数设置为：变性95℃ 2 min，热循环94℃5 s，60℃ 70 s，29个循环，终延伸60℃30 min，4℃保温。

3. 电泳与分型

通过ABI 3130XL遗传分析仪进行毛细管电泳检测，样品制备：1.0 μL扩增产物与9.0 μL上样缓冲液混合。上样缓冲液包含8.5 μL Hi-Di甲酰胺以及0.5 μL内标。X-STR基因分型通过GeneMapperID-X软件完成，包括19个X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）。

四、统计学处理

使用SPSS 25.0对男、女群体之间各基因座的等位基因频率分布差异进行χ2检验。应用Arlequin 3.5对女性样本分型数据进行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验和各基因座间进行连锁不平衡检验。使用在线X-STR数据库（http：//www.chrx-str.org/）计算该19个X-STR的法医学应用参数。通过收集19个X-STR荧光检测体系Allelic Ladder电泳的16个通道的电泳数据计算每个等位基因片段的电泳迁移率。Stutter比率为Stutter峰高与相应等位基因峰高的比值。α = 0.05，多重比较采用Bonferroni法。

结果

一、种属特异性验证

检测猩猩、猴子、牛、羊、狗、鸡、鸭、龙猫、猫和仓鼠的样本，除猩猩的样本检测到非特异性扩增片段之外，其它物种均未发现扩增片段。

二、灵敏度实验

使用9947A梯度稀释模板量分别为1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.0312 50 ng进行扩增检测。19个X-STR完整分型的最低模板量为0.25 ng。

三、抗抑制剂实验

血红素、靛蓝、腐殖酸和EDTA 4种抑制剂对该检测系统检出完整等位基因分型干扰浓度分别为125 μmol/L、750 μmol/L、5 ng/μL、0.8 mmol/L。

四、精确性实验

通过使用3500XL遗传分析仪（容忍范围0.50 bp）上电泳24份等位基因分型标准物并统计片段迁移率，虽然基因座DXS7423和HPRTB表现出较大迁移率，但是两者的迁移率均在0.20 bp之内，没有超出遗传分析仪的容忍范围，见图1。

五、可重复性实验

不同组织男、女样本各1份，分别使用3台不同仪器（3500、3500XL、3130XL）进行电泳检测，每组重复3次，均得到一致结果，峰高均在1500 rfu以上。

六、一致性实验

196份群体样本中与AGCU 19X STR试剂盒共有的7个基因座（DSX10079、DXS101、DXS10135、DXS10162、DXS6809、DXS7423、HPRTB）均得出相同的基因分型。

七、混合样本实验

通过混合标准品2800M和标准品9947A进行检验，在1∶1混合的样本中检出完整基因分型，但小于或等于1∶4时，DNA含量低的样本出现遗传标记丢失，丢失的片段主要为长片段。

八、陈旧检材实验

选取12份陈旧血样，同步使用MRX19与AGCU X19试剂盒进行检验。12份样本所有基因座全部得到完整分型，表明MRX19检出效能较高，并与AGCU X19荧光检测试剂盒进行比较，分型结果一致。

九、PCR优化

1. 循环数梯度

使用25 μL体系对0.5 ng 9947A进行扩增，设置5个循环数目梯度，分别为27、28、29、30 和31。荧光峰值随着循环数的增加而升高，循环数为27时可以得到完整基因分型，样本在29个扩增循环数时，各基因座扩增的荧光均衡性更好，而当循环数超过30时由于荧光峰值过高，个别基因座出现荧光渗透现象，影响相同片段大小的其他等位基因的分型。

2. 退火温度梯度

以56、58、60、62、64 ℃的5个温度梯度对体系的退火温度耐受性进行测试，均能得到完整的基因分型，且60 ℃时产物片段荧光峰值和特异性最好，除64 ℃时DXS6807基因座杂合子峰高比为0.207，其余温度时该体系14个基因座的杂合子峰高比均在0.6～1.0，均衡性较好，见图2。

3. 终延伸时间梯度

取0、15、30、45、60 min 5个时间梯度进行扩增。当延伸时间高于15 min时，目的峰没有减A峰出现，高于30 min时处于稳定，因此该体系最佳延伸时间设置为30 min。

十、Stutter峰研究

统计了50个南方汉族无关个体的样本数据从而得出每个基因座的Stutter范围并进一步加权分析后算出Stutter峰值，结果显示19个X-STR基因座的Stutter峰平均比率均低于15%。

十一、群体多态性检测

检测196份无关个体19个X-STR基因座均符合H-W平衡（P > 0.05/19），且19个X-STR基因座相互之间未出现连锁不平衡状态（P > 0.05/171）。杂合度观察值（Ho）为0.3151～0.9178，杂合度期望值（He）为0.2927～0.9249，多态性信息含量（PIC）为0.2633～0.9173，其中PIC最為丰富的基因座为DXS10135。此外，DXS10135、DXS10079、DXS6809、DXS10162、DXS981、GATA31E08、DXS101等7个基因座的PIC均大于0.7。另外，男性群体中的累积个体识别能力（TDP）大于0.999 999 999 874，女性群体中的TDP大于0.999 999 999 999。累积平均排除概率（MEC）在三联体案件中大于0.999 999 999 298，在二联体案件中大于0.999 999 500 495。共检出151个等位基因，基因频率分布在0.0037～0.8439之间。等位基因数目最多的DXS10135检出21个等位基因，等位基因数目最少的DXS7423仅有4个等位基因被检出，见表1。

讨论

本研究参照SWGDAM的验证指南，对MRX19进行法医学应用评估。种属特性实验结果显示，仅来源于猩猩DNA的样本出现了非特异扩增片段，而其他样本均未出现扩增片段，表明该体系具有较好的种属特异性。该体系在模板量大于等于0.025 ng可获得完整分型，显示灵敏度高。12份陈旧、微量检材全部得到完整基因分型，显示该体系可用于案件检材。在抗抑制试验中，加入法医实践中常见的抑制物血红素、靛蓝、EDTA等，结果显示该体系对抑制剂有较好的耐受性。

PCR循环数优化实验结果表明，该体系在循环数为27的PCR体系中可以得到完整基因分型，循环数为29时各基因座扩增均衡性最佳，而当循环数超过30时会产生荧光渗透现象。退火温度优化实验中，该体系在56～64℃均能得到完整的基因分型， 60℃时PCR效率最高，即产物片段荧光峰值和特异性最好。本实验数据为该扩增体系在实际应用中进一步优化提供了借鉴。

在法医学实践中，由于X-STR特有的遗传特征，常被作为重要的技术手段应用于复杂亲权鉴定及男女混合样本检测。然而目前应用的X-STR检测试剂盒主要为德国Qiagen公司基于国外人群数据开发的试剂盒，可检出12个X-STR遗传标记，遗传标记数目少，集中在4个连锁簇内，除了价格较高以外该试剂盒检测中国人群基因多态性的灵敏度较低[6]。因此，研发基于中国人群基因多态性的新型X-STR试剂盒有非常重要的意义。中德美联的AGCU X19荧光检测体系能检测19个X-STR，优势为位点较多，经过应用验证并获得较多中国群体法医学应用参数，能比较清晰了解其中的连锁重组关系，基因座主要分布在7个连锁簇内，计算复杂亲缘关系时可以更精准地计算似然率值[7-8]。本次研究的196份样本中，MRX19与AGCU X19荧光检测体系在共有的7个基因座获得相同的基因分型，提示MRX19分型准确性高。MRX19的优势是X-STR基因座间遗传距离较远，基本认为独立遗传，在本次实验中使用女性样本的分型数据进行连锁不平衡检验，结果显示所有基因座的组合均未发现连锁不平衡状态（P均 > 0.05/171），表明该群体在此19个X-STR基因座的等位基因频率及基因型频率处于遗传平衡状态，内部各基因座的遗传是相互独立的。

另外，MRX19体系全部19个X-STR基因座的男、女性等位基因分布比较差异均无统计学意义，故将男女性进行合并计算。女性样本的所有基因座均符合H-W平衡。该体系的累积个体识别能力在男性群体中大于0.999 999 999 874，在女性群体中大于0.999 999 999 999;在三联体案件中的累积平均排除概率大于0.999 999 999 298，在二联体中的累積平均排除概率大于0.999 999 500 495，结果表明该检测体系具有良好的多态性，单独使用这套遗传标记可以获得较高的个体识别率;配合连锁簇内的X-STR遗传标记使用，在计算复杂亲缘关系时可获得更高的准确性，该体系适用于法医个体识别及补充复杂亲缘关系的鉴定。

参 考 文 献

[1] 刘耀，丛斌，胡丙杰. 中国法医学70年理论与实践. 北京：科学出版社，2019：114-118.

[2] 曾祥培，李海霞，孙宏钰. X-STR基因座的法医学应用研究进展. 中国司法鉴定， 2010，48（1）：58-62.

[3] Yang X， Zhang X， Zhu J， Chen L， Liu C， Feng X， Chen L， Wang H， Liu C. Genetic analysis of 19 X chromosome STR loci for forensic purposes in four Chinese ethnic groups. Sci Rep， 2017， 7：42782.

[4] Yang X， Wu W， Chen L， Liu C， Zhang X， Chen L， Feng X， Wang H， Liu C. Development of the 19 X-STR loci multiplex system and genetic analysis of a Zhejiang Han population in China. Electrophoresis， 2016， 37（15-16）：2260-2272.

[5] Scientific Working Group on DNA Analysis Methods （SWGDAM）. Revised Validation Guidelines.[2020-09-20]. https：//view.officeapps.live.com/op/view.aspx？src=https%3A%2F%2Fstrbase.nist.gov%2Fvalidation%2FSWGDAM_Validation.doc&wdOrigin=BROWSELINK.

[6] Zhang S， Zhao S， Zhu R， Li C. Genetic polymorphisms of 12 X-STR for forensic purposes in Shanghai Han population from China. Mol Biol Rep， 2012， 39（5）：5705-5707.

[7] Xiao C， Li S， Zhang X， Yang X， Liu C， Chen L. Population genetic analysis of Chinese Zhuang and Mulao minorities using AGCU-X19 STR kit. Int J Legal Med， 2020， 134（2）：501-503.

[8] 张晓芳. 19个X-STR荧光检测体系的法医学验证及其多态性调查. 广州：南方医科大学，2018.

（收稿日期：2021-02-20）

（本文编辑：林燕薇）