N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍灌胃配合复合因素建立大鼠胃癌模型*

李璐璐，陈国忠，吴瑕，袁铁超，王婕，欧智海，易志忠

1.广西中医药大学，广西 南宁 530000； 2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530000

在肿瘤的发生中，胃癌因其极高的发生率和致死率，以及逐渐趋向年轻化，严重威胁人类的健康。2018年，我国胃癌的发病人数已占全球总发病人数的45%。及时干预并阻断胃癌前病变的进展能降低胃癌发生率，达到二级预防效果。因此，研究胃癌前病变进展过程，探讨胃癌的发病机制，建立一个稳定可靠的动物胃癌模型成为治疗的首要前提。本实验选择目前常用的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-Methyl-N′-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG)给药方式和浓度并进行改良[1-4]，探讨一种新的简单易行、实用性强的造模方式。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性Wistar大鼠50只，4周龄，体质量(50±2) g，购于广西医科大学实验动物中心，在广西中医药大学实验中心饲养，每笼3～4只，室温25 ℃，每天光照10 h，非造模时常规饮食和饮用水饲养。动物使用许可证号：SCXK(桂)2009-2003。实验涉及动物的饲养和实验过程中严格遵守广西中医药大学实验动物管理与保护的有关准则。

1.2 试剂MNNG(东京化成工业株式会社，批号：8WF3N-JQ)；含2%氯化钠的高盐饲料(南京盛民科研动物养殖场，批号：3105231)；40 ng·L-1多聚甲醛通用型组织固定液(北京兰杰柯科技有限公司，货号：70081800)；苏木素染色液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0107)；盐酸乙醇快速分化液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0163M)；伊红染液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0109)；中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9555)；水合氯醛(成都市科隆化学品有限公司，货号：302-17-0)；二甲苯(天津市永大化学试剂有限公司)；无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司，批号：20160908)；体积分数95%乙醇(天津市永大化学试剂有限公司，批号：20160806)。

1.3 仪器KD-T型生物组织摊烤片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；BX43型光学显微镜(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 建立动物模型将50只大鼠随机分为对照组和实验组，每组25只。对照组予生理盐水灌胃，实验组以100 g·L-1MNNG为起始浓度，之后每10周增加25%，直到浓度为150 g·L-1的方式灌胃，连续灌胃40周。对照组正常饲料和频率喂食，实验组均以高盐饲料喂食并配合饥饱失常(饥1天，饱1天)，同时予常规饮用水饮用。

2.2 大鼠体质量变化在第20周时分别从各实验组与对照组中随机抽取10只大鼠称体质量。

2.3 收集大鼠胃组织实验组每日灌胃1次，从第16周时开始，每隔4周分别从不同组随机抽取3只大鼠处死(实验过程中自行死亡的大鼠也需及时进行尸检)，至第40周全部处死。暴露并游离胃，将胃切开，首先在肿瘤组织中取标本，若无肉眼肿物则分别在胃底、胃体、胃小弯、幽门及十二指肠取材，40 ng·L-1多聚甲醛固定，送病理科进行病理组织鉴定，记录并对比各组胃癌组织的发生时间、浸润侵袭情况及突破黏膜层的程度。

3 结果

3.1 大鼠的一般状态对照组大鼠饮食正常，体质量增加，反应灵敏，皮毛光泽。实验组大鼠进食减少，体质量减轻，反应迟钝，皮毛晦暗，嗜睡，蜷缩，无精神。与对照组比较，实验组大鼠在第20周时体质量极显著降低(P<0.01)，见表1。

表1 第20周时大鼠体质量比较

3.2 病理结果当胃组织中有不同程度的异型增生、或肠化，或提示胃癌，表示造模成功。实验组第24周造模成功，病理提示肠化生伴轻度不典型增生；第26周大鼠自行死亡1例，病理提示轻度异型增生伴肠化生。第30周自行死亡1例，病理结果提示胃癌，其中各组自行死亡大鼠或因死亡时间过长未送病检，或病理结果未提示造模成功的，不纳入总计数量。实验组成模情况为胃组织出现重度不典型增生3只、轻度不典型增生3只、肠化生7只、胃癌4只，无效4只，成功率80.95%。实验组不同周数的病理演变见图1～图5。

注：A：(HE染色，×100)；B：(HE染色，×200)；C：(HE染色，×400)图1 正常组大鼠胃组织16～20周形态学变化

图2 实验组胃组织24～26周(肠化生)病理损伤变化(HE染色，×200)

图3 实验组胃组织28～30周(轻度不典型增生)病理损伤变化(HE染色，×400)

图4 实验组胃组织28～30周(重度不典型增生)病理损伤变化(HE染色，×200)

图5 实验组胃组织30～40周(胃癌)病理损伤变化(HE染色，×200)

3.3 两组大鼠存活情况统计对照组存活22只，存活率88.0%；自行死亡3只，死亡率12%。实验组存活19只，存活率76.0%；自行死亡6只，死亡率24%。见表2。

表2 两组大鼠存活情况统计

4 讨论

研究认为，胃癌典型发展顺序是：慢性炎症-萎缩性胃炎-萎缩性胃炎伴肠化生-异型增生-胃癌[5-6]，这一过程与多因素作用相关。造模时需参考这些因素并应用。目前大鼠胃癌造模尚无公认的造模方法，尽管MNNG试剂已被广泛应用，但给药方式、时间和浓度的差异会导致诱发率低且周期较长，实验模式复杂，操作繁琐，实验成本较高，难以达到预期的效果。而MNNG单因素诱发胃癌造模成功率较低，因此常配合高盐食物、酒精[7-8]、幽门螺杆菌[9]等多种复合因素的干预以提高效率。设计实验时，实验组模拟胃癌形成的过程，仅将高盐饲料及饥饱失常作为危险因素在大鼠胃癌造模中联合应用，简化实验。

研究认为，高盐可以破坏胃黏膜屏障[10-11]，使得胃黏膜处于损伤-修复-再损伤的循环，炎症细胞浸润，对肿瘤细胞的生长和转移均有促进作用，诱导胃组织的异型增生。长期饮食不规律也是诱发胃癌的高危因素[12]，会造成胃蠕动及排空的失衡，增加MNNG及高盐饲料与胃黏膜接触时间，进一步损伤保护屏障。已知MNNG使用方式有自由饮用和灌胃两种模式，在前期实验发现，MNNG药物采用自由饮用方式干预，受大鼠的个体差异(如食欲、情绪、环境等)影响较大，实际摄入量无法把控，难以达到理想浓度，使得造模拖延。因此，实验组采用灌胃模式，尽可能保证药物摄入。结合目前已报道的文献[13-16]，MNNG给药浓度和时间无明确定论，多数实验将MNNG浓度设在100～200 ng·L-1，饮用MNNG 20～40周可成功造模，灌胃MNNG在10～30周可成功造模，但造模成功率无法保证，且造模成功节点无明确阐释，对大鼠死亡率并无确切描述。在设计本次实验时，实验组采用以100 ng·L-1为起始浓度，之后每10周增加25%的梯度浓度造模，采用循序渐进的方法。

研究显示[17]，低浓度MNNG灌胃造模时间较长，成功率低，其原因不排除随着大鼠周数的增长，大鼠出现耐药情况，低浓度不再敏感，且低浓度MNNG灌胃后大鼠胃组织病理变化以肠化生为主，无法得到理想的胃癌病变模型。高浓度MNNG持续灌胃可建立大鼠胃癌模型，但对大鼠刺激较大，死亡率非常高，胃组织容易出现黏膜发生突变，进展过程隐匿且迅速，胃癌的发病模式无法体现上述人类典型模式[18]。当胃黏膜病变进展过快，对实验标本采集时间的掌握和灵活度要求更高，实验难度系数增大。因此本研究目的是探讨如何简化实验，运用梯度灌胃MNNG，是否既能保证摄入浓度，尽可能减少大鼠死亡率，又能获得良好连续的造模效果，这也是本课题的意义所在。

本研究实验组成功率可达到80.95%，成功率较高，整个过程完整、连续，第16周可见大鼠胃黏膜有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润，20周胃底腺可见萎缩并减少，黏膜变薄，24周可见轻度不典型增生伴肠腺化生，28周可见胃腺体重度不典型增生，30周可见早癌组织，黏膜层连续完整，第32周可见浸润到肌层，第36周胃癌突破到浆膜层，清晰呈现从胃炎发展到胃癌的不同阶段。实验组存活率为76%，与对照组相比，差异无统计学意义。与其他同类型实验比较，存活率更高[19]。实验过程中出现大鼠死亡的因素大多为灌胃操作导致的机械性损伤。本研究发现，实验组与对照组存活率无明显差异，提示实验组递进MNNG浓度灌胃并不会造成大鼠死亡率的增加，优于其他类型MNNG诱导胃癌模型[3-4]。本研究实验组前期采用低剂量MNNG大鼠逐渐适应，后期随着大鼠周龄增大并递增给药剂量，在一定程度上可改善大鼠耐药情况，让大鼠在耐受的情况下保证尽可能多的摄入MNNG，也能减轻因剂量突然变化对其的刺激影响，减少大鼠死亡率。本研究发现，大鼠的死亡主要发生在后期，此时大鼠进食减少，体质量迅速下降，解剖时发现食管和胃黏膜潮红、大量散在糜烂病灶和活动性溃疡，肠胀气明显，考虑除了灌胃引起的机械性损伤外，可能与高浓度MNNG毒性增大引起的急性黏膜损伤相关。

胃癌前病变是胃癌发生的重要节点，这一阶段的早期诊断和干预是胃癌防控的关键，截断甚至逆转胃癌前病变的发展成了目前研究的热点，而建立一个高效可行的胃癌前病变模型，尤为关键。实验组造模过程稳定完整，可为研究癌前病变各个阶段特征、探讨药物干预的时机及指导抗肿瘤治疗提供优良的模型。造模方式简单易行，对实验设备及操作要求较低，与人类的病理发病情况相符，保证造模的真实性和实用性，便于推广。结合本实验数据提示36周是理想的造模周期，若要获取胃癌前病变的模型，可灵活提前至24周；若要造模时间更短，可调整递增浓度的时间区间，不建议再提高递增的浓度。

使用MNNG诱导胃癌的造模方式，并不断寻找MNNG最佳浓度以获得最好的效果。研究发现，不同月龄大鼠其脏器系数、组织学异常及疾病的发生与年龄呈现出相关性，因此课题组认为，随着大鼠周数的改变设置时间和浓度区间，更能保证造模的质和量，减少药物的浪费与污染[20]。但如何根据不同月龄大鼠生理病理差异设计出更精准的区间，仍然需要大量的后期摸索，各实验室应该根据自身条件不断设计并积累研究数据，总结经验，以供参考。

采用MNNG梯度浓度结合复合因素的方法，可成功建立理想的大鼠胃癌模型，此法诱发率高、周期短、实验简单、费用低，在大鼠胃癌造模方式中，尤其是在观察胃癌前病变的发生和发展方面，更具优势。