基于生物质能源生产的布朗葡萄藻营养供给方式选择

钱守元，周泽鹏，郁彬琦，刘青，靳翠丽，周晓见

（扬州大学环境科学与工程学院，江苏 扬州 225127）

关键字：布朗葡萄藻，油脂，生长，营养供给。

化石能源日益紧缺，生物能源作为可再生能源的重要种类，被寄予厚望。微藻光合作用捕获固定大气CO2，富含脂肪、蛋白、多糖、类胡萝卜素，被认为是第三代生物能源开发的重要种类，具有良好的综合开发前景[1,2]。布朗葡萄藻Botryococcus braunii细胞脂肪含量高，还特别具有大量储存碳氢化合物（类石油烃类产物）的能力，可以不经过酯交换反应而直接精炼获得石油烃，被认为是最有开发前景的生产生物燃料的微藻之一[3,4]。

目前，布朗葡萄藻规模化培养还面临一些问题，主要是藻细胞生长缓慢、倍增时间长，生产成本高。微藻生物柴油工业化发展进程中，高成本问题一直是普遍性的严重制约因素[5]。寻求合理的营养供给条件、提高细胞增殖速度、获得优良的产出效率，是实现布朗葡萄藻大规模培养的首要基础性问题。营养供给条件也涉及到培养液配制的材料和人工成本。本文通过比较代表性的富、中、贫营养水平对布朗葡萄藻营养供给形式的效果，分析各营养供给方式对细胞增殖速度和物质生产的影响，以期为布朗葡萄藻的开发利用提供基础性数据支持。

1 材料和方法

1.1 藻种来源

试验用布朗葡萄藻Botryococcus braunii 购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库，种株标号为FACHB-1106。

1.2 培养条件和试验设计

用营养供给水平不同的四种代表性的营养条件培养布朗葡萄藻，包括富营养的BG-11 培养基、贫营养的f/2 培养基、以及营养水平中等的改良Chu 培养基和SE 培养基，并按照万晶晶等的方法，将各培养基中的各成分划分为大量元素、微量元素和维生素三大类，各培养供给情况如表1[6]。

表1 不同营养条件下的营养供给（培养液中终浓度/mg·L-1）Tab.1 Nutrient supply under different nutrient conditions（final concentration in culture solution/mg·L-1）

用一次性培养方式（18 d）。各培养体系在250 mL 三角瓶中的无菌培养液体积均为150 mL，取对数生长期藻种接种，初始OD690均控制在0.02 左右（200 μL，透明96 孔板）。光暗比12h∶12h，光照强度4 000 lx；温度：（25±2）℃；摇床培养，转速100 r/min。

1.3 测定方法

1.3.1 细胞生长的测定

每72 h 取200 μL 摇匀的布朗葡萄，藻加入透明96 孔板，用Microplate Reader 酶标仪测定OD690，根据OD690绘制生长曲线。计算藻的比生长速率（μ），计算方法如下：

其中，μ 是比生长速率（d-1）；（OD690）t和（OD690）0分别表示t 时刻和培养开始时的OD690；t 为培养时间[7]。

1.3.2 细胞物质含量的测定

采用干重法测定最终生物量[8]，氯仿/甲醇抽提法测定藻总脂含量[9]，正己烷抽提法测定总烃含量[10]。采用考马斯亮蓝染色法测定藻细胞内可溶性蛋白质含量[11]，苯酚—硫酸法测总糖含量[12]。采用丙酮提取法测定藻细胞的光合色素含量[13]。具体方法如下：

取藻液110 mL 于4 000 r/min 离心10 min，用蒸馏水洗涤，去除上清，收集沉淀的藻泥。将藻泥移入样品瓶中，放入LABCONCO 冻干机，-40℃真空冻干24 h，再40℃真空干燥0.5 h，得干藻粉称重，为最终生物量干重。

称取干藻粉15 mg，加0.8 mL 蒸馏水震荡混匀，加入1 mL 氯仿、2 mL 甲醇，震荡混匀；超声破碎10 min，再加入1 mL 氯仿、1 mL 纯水，震荡混匀，于4 000 r/min 速度下离心10 min，保留下层氯仿层，加入等体积蒸馏水，离心，重复两次。将下层氯仿层转移到试管中，常温吹干，40℃烘箱烘干0.5 h，称重得到总脂的重量（干重），用总脂干重占生物量干重的百分比表示总脂含量。

每个装有总脂的试管中加入5 mL 正己烷，震荡使其充分溶解，离心，取上清正己烷可溶组，常温吹干，40℃烘箱烘干0.5 h，称重得总烃的质量，用总烃占干藻粉质量的百分比表示总烃含量。

取藻液10 mL，于4 000 r/min 离心10 min，去除上清液，用蒸馏水定容至10 mL。冰浴超声破碎细胞（700 w，超声5 s，间隔3 s）。再次离心，取上清液1 mL，加入5 mL 考马斯亮蓝染色液，静置反应5 min，在595 nm 处测定吸光值。根据同时测定的牛血清蛋白浓度和OD595的标准曲线计算得到蛋白质浓度，再转换为占干重的百分比表示可溶性蛋白质含量。

取可溶性蛋白质测定中处理好的上清液0.5 mL，分别加入6%的苯酚300 μL 和浓硫酸1.5 mL，震荡均匀，室温放置20 min，在490 nm 处测定吸光值，根据同时测定的葡萄糖浓度和OD490的标准曲线计算得到总糖浓度，再转换为占干重的百分比表示总糖含量。

取5 mL 藻液，4 000 r/min 离心10 min，收集沉淀，加入100%丙酮5 mL 并在4℃冰箱过夜。摇匀后4 000 r/min 离心10 min，收集上清液，分别在644 nm、661 nm 和470 nm 处测量光密度，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素总量，再将色素总量转换为占干重的百分比表示色素含量[13]。计算叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素总量的公式为：

1.3.3 物质产率的计算

各物质的产率计算公式为：

1.4 数据分析

所有实验重复三次，数据采用IBMSPSS 22 软件分析。用单因素ANOVA 分析四种培养基的培养效果。对方差分析显著的因素，利用最小显著差数法（LSD 法）或者Dunnett’s T3 进行多重比较。各分析指标差异显著性以P=0.05（以小写字母标注）或0.01（以大写字母标注）作为标准[14]。采用Microsoft Excel 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 营养条件对布朗葡萄藻生长的影响

在培养的18 d 内，布朗葡萄藻在四种营养条件下都能生长（图1）。双因素方差分析和多重比较发现，在0～18 d 的培养过程中，BG-11 培养效果显著优于其他三种培养基（P=0.01）。对各培养天数的OD 值进行单因素方差分析和多重比较发现，从第9 d 后各营养条件下的生长情况差异逐渐显现（P=0.05），12 d 时BG-11 的优势极显著（P=0.01）。18 d 内的比生长速率表明，布朗葡萄藻在BG-11 培养基中生长速度最快，比生长速率达到0.102（d-1），极显著高于其他三种培养基（P=0.01）。四种培养基中藻的比生长速率从大到小的顺序是：BG-11＞SE＞Chu＞f/2（图2-I）。收获时BG-11、Chu 和f/2 三种培养基中的布朗葡萄藻最终生物量干重差距不大，其中BG-11 培养基中布朗葡萄藻干重最高，达到329.3 mg/L，而SE 培养基中藻的干重最低，只有228.3 mg/L，显著低于其他三种培养基（P=0.05）（图2-II）。

图1 营养条件对布朗葡萄藻生长的影响Fig.1 The effect of nutritional conditions on the growth of alga Botryococcus braunii

图2 营养条件对布朗葡萄藻比生长速率（I）和干重（II）的影响Fig.2 The effect of nutritional conditions on the specific growth rate（I）and dry weight（II）of alga B.braunii

2.2 营养条件对布朗葡萄藻细胞物质生产与积累的影响

2.2.1 细胞总脂、总烃生产与积累的比较

在四种不同营养条件供给状态下培养18 d 后，布朗葡萄藻细胞生产和积累的总脂（P=0.05）、总烃（P=0.01）均有显著性差异（图3）。f/2 培养基总脂含量最高，达到35.6%，BG-11 培养基总脂含量最低，只有22.6%。四种培养基中藻的总脂含量从大到小依次为：f/2＞Chu＞SE＞BG-11（图3-I）。布朗葡萄藻的总烃含量最高值也出现在f/2 培养基，达到17.6%，在BG-11 培养基中最低，只有5.9%。四种培养基中藻的总烃含量从大到小依次为：f/2＞SE＞Chu＞BG-11（图3-II）。

图3 营养条件对布朗葡萄藻的总脂（I）和总烃含量（II）的影响Fig.3 The effect of nutritional conditions on the total lipid（I）and total hydrocarbon contents（II）of alga B.braunii

2.2.2 细胞可溶性蛋白质和总糖生产与积累的比较

布朗葡萄藻生产和积累的可溶性蛋白质受营养条件的影响不大（图4）。培养18 d 后，四种培养基中的布朗葡萄藻细胞内积累的可溶性蛋白质都在11.5%～13.1%之间，各组间差异性不显著（P=0.05）（图4-I）。而总糖积累受培养基的影响很明显，BG-11 培养基中总糖含量显著高于其他三种培养基（P=0.01），最高值达7.1%，是其他三种培养基总糖含量的近2 倍（图4-II）。

图4 营养条件对布朗葡萄藻的可溶性蛋白质（I）和总糖（II）积累的影响Fig.4 The effect of nutritional conditions on the accumulation of soluble protein（I）and total sugar（II）in B.braunii

2.2.3 细胞主要色素生产与积累的比较

布朗葡萄藻的色素积累受培养基营养水平影响较大，细胞内的主要色素、叶绿素a 和类胡萝卜素的生产和积累都有所差异。布朗葡萄藻细胞的类胡萝卜素含量远高于叶绿素a 含量。四种培养基中的叶绿素a 含量没有统计学差异（P=0.05），但f/2 培养基中的叶绿素a 含量较高，能达到0.2%（图5-I）。四种培养基中生长的布朗葡萄藻的类胡萝卜素含量差异显著（P=0.05），f/2 培养基最高，含量达0.21%，BG-11 和Chu 的的类胡萝卜素含量也都接近0.14%，而SE 培养基中的类胡萝卜素含量很低，只有0.12%（图5-II）。f/2 培养基中的布朗葡萄藻的叶绿素a 含量、类胡萝卜素含量都最高，SE 培养基中的布朗葡萄藻两种主要色素的含量都最低（图5）。

图5 营养条件对布朗葡萄藻叶绿素a（I）和类胡萝卜素（II）积累的影响Fig.5 The effect of nutritional conditions on the accumulation of chlorophyll a（I）and carotenoids（II）in alga B.braunii

2.3 布朗葡萄藻各物质产率的比较

藻细胞的物质产率取决于单位时间内单位体积培养体系的生产和积累能力，是培养体系中细胞总数量以及单个细胞物质生产和积累能力的综合体现。在不同营养条件下，布朗葡萄藻各物质产率的比较如表2 所示。

表2 营养条件对布朗葡萄藻各物质产率的影响/mg·（L·d）-1Tab.2 The effect of nutritional conditions on the yield of various substances in alga B.braunii/mg·（L·d）-1

从脂类产率看，BG-11、Chu 和f/2 三种营养条件差异不大，总脂产率最高的是f/2 培养基，高达575.64 mg/（L·d），产率最低的是SE 培养基，显著低于上述三种培养基（P=0.05），总脂产率不足f/2 培养基的60%。从总烃产率看，产率最高的是f/2 培养基，高达286.87 mg/（L·d）。产率最低的是BG-11 培养基，显著低于上述三种培养基（P=0.05），总烃产量不足f/2 培养基的40%。SE 培养基的可溶性蛋白质产率最低，只有151.10 mg/（L·d），显著低于其他三种培养基（P=0.05）。最高的是BG-11 培养基，能够达到234.77 mg/（L·d）。BG-11 培养基的总糖产率显著高于其他三种培养基（P=0.01），能够达到128.21 mg/（L·d）。叶绿素a 的产率和类胡萝卜素产率相似，都是f/2 培养基显著高于其他处理组，f/2 培养基中叶绿素a 和类胡萝卜素的产率可达3.27 mg/（L·d）和3.41 mg/（L·d）。总脂、总烃、总类胡萝卜素和叶绿素a 四种物质的产率都是f/2 培养基最高。水溶性蛋白质和总糖的产率，BG-11 培养基则最高。

2.4 营养供给对布朗葡萄藻生产的投入产出的比较

BG11 培养基提供的营养成分总浓度最高，达到1689.4100mg/L，而f/2 培养基最低，仅85.9911mg/L，二者相差近19.65 倍。SE 培养基和Chu 培养基的外加营养成分总浓度居中，分别为635.4670 mg/L 和394.0615 mg/L（表1）。所获得的总细胞干重（mg/L）/营养成分总投入（mg/L）（图6-I）和总脂产量（mg/L）/营养成分总供给（mg/L）（图6-II）表明，f/2 培养基的细胞干重产出/营养投入的比值显著高于其他三种培养基（P=0.01），达到3.387，是最低的BG11 组（比值为0.195）的17.37 倍。同样，f/2 组的总脂产出/营养投入的比值为1.205，也显著高于其他三种培养基（P=0.01），是最低组BG11（比值为0.045）的26.78倍。

图6 营养成分供给对布朗葡萄藻细胞干重（I）和总脂（II）投入产出效率的影响Fig.6 The effect of nutrient supply on the input-output efficiency of cell dry weight（I）and total lipid（II）in alga B.braunii

3 讨论

微藻的生长与培养体系的营养元素供给密切相关，每种藻类对营养的需求也不同[2]。本文研究了基于BG-11、Chu、f/2 和SE 四种配方的营养供给条件下，布朗葡萄藻的生长。按照大量元素、微量元素和维生素的含量，这四种培养基大致可分为三类：富营养（BG-11）、中营养（Chu 和SE）和贫营养（f/2）三类。其中BG-11 的N、P、Fe、微量元素含量远远高于其他三种培养基，尤其是N 分别为Chu、SE 和f/2的7.5 倍、6 倍和20 倍；它还含有独有的无机C 源（Na2CO3），可能促进藻细胞迅速繁殖[14]。因此，将BG-11 划分为富营养培养基，其总营养成分约为1.69 g/L，也是成本较高的培养基。Chu 和SE 的大量元素含量居中，总营养成分分别约为0.39 g/L 和0.64 g/L，是中营养培养基。f/2 培养基的大量元素含量最低，不仅N 只有BG-11 的1/20，P 和Fe 的含量也远远低于其他培养基，总营养成分添加量仅0.09 g/L，是贫营养培养基。选用的四种培养基都广泛用于藻类培养，也常用于培养布朗葡萄藻[8]。本实验结果表明，培养基营养元素在本实验使用的浓度范围内的贫富程度决定了布朗葡萄藻的生长速度。富营养培养基如BG-11 比生长速率大，贫营养培养基如f/2，比生长速率小，中营养培养基的比生长速率居中。单个藻细胞中的基础结构性物质如蛋白质的生产和积累受营养供给的影响小，而总脂、总烃、总糖和类胡萝卜素等储存性物质的含量受影响显著。贫营养培养基f/2 更有利于布朗葡萄藻积累储存性物质，其总脂、总烃和类胡萝卜素含量都最高。富营养培养基BG-11 不利于总脂和总烃的积累，但总糖含量却最高。碳水化合物与油脂是生物体内两种不同形式的储能物质。大多数微藻细胞处于营养胁迫状态下，会将光合作用合成的碳源更多地向脂肪酸或中性脂方向转化，原因是脂肪的能量要高于碳水化合物[16]。营养供给的不足改变藻类的代谢通路，加强脂类合成和积累，可以增加藻类细胞中的甘油三酯（TAG）等油脂占比[17,18]。所以，贫营养供给有利于储存性脂类积累。相反，在营养充分的条件下，藻类将合成的有机碳偏向消耗性糖类[16]。

从物质产率而言，除了细胞干重主要取决于生长速度。其他的物质产率均取决于生长速度和物质含量两方面的综合效益。富营养的BG-11 有利于积累生物量，但不利于积累储存性物质；贫营养的f/2虽然生物量低，但细胞积累的储存性物质含量很高。而最终物质产率的高低取决于细胞干重和物质含量的乘积。所以，虽然富营养的BG-11 获得的细胞干重显著高于贫营养的f/2，但其总脂含量、总烃含量、总类胡萝卜素含量分别仅为后者的0.63、0.34和0.71 倍，导致BG-11 培养的藻细胞总脂产率最低。从色素含量上看，f/2 培养基中布朗葡萄藻的叶绿素a 和总类胡萝卜素含量都最高，其光合潜力也高于其他处理[16]，导致贫营养培养基f/2 更适合于布朗葡萄藻储存性物质的生产。由图6 可知，单位质量的营养投入，所获得的最终细胞干重和总脂的产出都是f/2 最高。所以，从营养物质供给的投入产出效率上来讲，f/2 也是最优的选择。

为了获得大量生物质油脂产出，需要使微藻处于低营养的胁迫环境，促使细胞积累油脂，但不可避免地引起细胞生长速度受限。为解决这类矛盾，二段培养可能是解决途径，第一阶段为微藻提供最佳的生长条件，专注于获得最大生物量；第二阶段把充分生长的微藻转移到寡营养条件下，专注于油脂生产[1]。在布朗葡萄藻二段培养中，建议第一阶段选择如BG-11 的富营养培养基，第二阶段选择如f/2 的贫营养培养基。