丁酸梭菌对水产动物营养及免疫研究进展

李芳源，王常安，刘红柏

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.南京农业大学，江苏 南京 210000）

随着水产养殖业不断发展，能提高水产动物生长性能或者预防、治疗疾病的功能性饲料添加剂备受养殖者的青睐[1]。在多种功能性添加剂中，抗生素的使用比例远高于其他添加剂。抗生素可显著提高水产品的产量，降低养殖成本[2]，但是，抗生素的细菌耐药性与抗生素残留关系到水产养殖业的可持续发展和人类健康[3]。

2003 年，欧盟（EU）在（EC）1831/2003 号条例中指出：“除抗球虫药或单抗药物外，抗生素不得作为饲料添加剂”[4]。这一禁令使科学界迫切寻找减少抗生素使用的替代品，而最具潜力的饲料添加剂之一就是益生菌。1986 年Kozasa[5]首次将益生菌应用于水产养殖，van Doan 等[4]对益生菌重新定义“益生菌最初是从饲喂宿主的水或宿主的胃肠道中分离出来的，能够改善宿主的生长和健康”。丁酸梭菌Clostridium butyricum 作为一种益生菌，很早便被国外学者关注，而我国对丁酸梭菌的研究起步较晚。农业部于2009 年7 月将丁酸梭菌制剂列为微生物饲料添加剂用于畜禽养殖。由于丁酸梭菌或其代谢产物能够改变肠道的菌群结构，提高肠道中消化酶、淀粉酶等酶的活性和肠道对营养物质的消化吸收能力，调节肠道免疫反应中的细胞因子或影响免疫反应的路径来提高水产动物肠道的抗炎能力[6]，近年来其应用受到关注，广泛用于水产养殖业。

1 丁酸梭菌简述

1.1 理化性质

丁酸梭菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性产芽孢杆菌[7]。菌体常单个或多个存在，两端钝圆，周身鞭毛，具有运动性[8]。该菌分布广泛，既可存活于土壤中，也可存活在人和动物的肠道中，是一种常见的人和动物肠道共生细菌。该菌能产生内生孢子，对环境有较好的抗逆性；耐肠胃消化液，最适生长pH 为7.2；广温性，在100℃加热5 min 不失活，37℃下生长最适，可在室温条件下保存[9]。

1.2 生物学特性

丁酸梭菌能够利用大肠中未消化的碳水化合物发酵产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸。短链脂肪酸是肠上皮细胞的重要营养物质，除了能够维持肠上皮结构的完整性，还能为肠道提供酸性环境，抑制肠道有害菌的生长[10]。丁酸梭菌能够分泌消化酶、等促进肠道消化；能够提高肠道的免疫能力，治疗肠道某些疾病[11]。丁酸梭菌的另一特点是对大部分抗生素具有抗性[12]。

2 丁酸梭菌对水产动物生长性能的影响

近年来，对益生菌的各种功效研究受到广泛关注，并证实了它们能够影响水产动物的生长性能和健康水平[3]。樊英等[13]研究发现，饲料中单独和联合添加丁酸梭菌及凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，虹鳟Oncorhynchus mykiss 的特定生长率和粗蛋白含量均高于对照组。Li 等[14]在饲料中添加不同浓度的丁酸梭菌，结果发现，罗非鱼Oreochromis niloticus 的特定生长率随丁酸梭菌浓度的增加而增加，最佳剂量为1×105CFU·g-1。类似的结果在凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei[6,15]、斑节对虾Penaeus monodon[16]、Miichthys miiuy[17]、鳗鲡Anguilla japonica[18]和银鲳Pampus argenteus[19]等研究中得到进一步验证。丁酸梭菌一般在水产动物的肠道中进行厌氧发酵，提高饲料营养性能，发酵生成可溶性单糖、氨基酸等有机物，进入细胞后被吸收利用，能提高水产动物肠道对营养的吸收能力，促进动物生长[20]。也有研究发现，丁酸梭菌可作为水质改良剂，改善水环境，降低水产动物的发病率和死亡率。

3 丁酸梭菌对水产动物肠道健康的影响

3.1 肠道酶活性的影响

丁酸梭菌可产生脂肪酶、淀粉酶等消化酶，能消除部分抗营养因子的影响[21]。Foysal 等[22]给螯虾Cherax cainii 饲喂丁酸梭菌后，血淋巴中的溶菌酶活性提高。Mohammad 等[23]发现，益生菌能够提高里海鳟Salmo trutta caspius 肠道内溶菌酶的活性。多种益生菌混合能提高里海白鱼Rutilus frisii kutum幼鱼皮肤粘液中的溶菌酶[24]及碱性磷酸酶（ALP）和蛋白酶的酶活性。Valipour 等[25]给窄指河螯虾Astacus leptodactylus饲喂含有浓度为107CFU·g-1、108CFU·g-1和109CFU·g-1植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 的饲料，发现其蛋白酶、淀粉酶和ALP 活性升高。在鲤Cyprinus carpio、牙鲆Paralichthys olivaceus 和虹鳟的研究中也得到类似的结果[26,27]。Pan等[28]发现：丁酸梭菌能够降低小鼠因急性胰腺炎而过度升高的血清淀粉酶和脂肪酶活性。在凡纳滨对虾的研究中也有类似报道[29]。

3.2 肠道菌群的影响

肠道菌群可在宿主体内形成稳定的微生态系统，机体某些疾病的发生与菌群失调或肠道微生物组成异常有关[30]。肠道菌群失衡将打破机体的平衡，外界有害菌或自身有害菌将大量增殖，发生各种疾病，因此，维持肠道菌群稳定十分重要。Li 等[31]用无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，GBS）攻毒罗非鱼后，在日粮中添加丁酸梭菌（1×105CFU·g-1、1×106CFU·g-1和1×107CFU·g-1）探究其是否具有抑菌作用。结果显示：丁酸梭菌能降低罗非鱼的累计死亡率。Pan 等[32]给攻毒鳗弧菌Vibrio anguillarum 或嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 后，在饲料中分别添加活的及灭活的丁酸梭菌，结果与未添加丁酸梭菌攻毒组相比，添加活菌及灭活菌的攻毒组死亡率均降低。樊英等[12]在研究丁酸梭菌对虹鳟肠道菌群的影响实验中也得到了类似的结果。Rimoldi 等[33]研究发现，饲喂添加了益生元的饲料后，欧洲鲈Dicentrarchus labrax 的弧菌数量也减少。日粮中添加丁酸梭菌在对凡纳滨对虾[29]中发现减少了潜在的肠道病原体数量，增加了有益的细菌。这可能是由于丁酸梭菌产生了丁酸、乙酸等酸性物质，使肠道pH 降低，抑制不耐酸致病菌如大肠杆菌Escherichia coli、沙门氏菌Salmonella、弧菌Vibrio等的生长，并且能够与致病菌粘附，抑制其在鱼肠上皮细胞定植，也大大减少了肠道内的致病菌数量[34,35]，促进了肠道有益菌的生长[36]。丁酸梭菌产生的脂肪酸能够与胆汁酸结合，共同抵抗致病菌产生的毒素。

3.3 肠道结构的影响

肠道结构的完整性直接影响机体对营养物质的利用及各种生理活动。肠道中绒毛的长度和隐窝的深度是肠道功能重要的形态学参数，小肠绒毛长度增加能够促进消化吸收，隐窝深度变浅有利于肠上皮细胞的发育。肠道绒毛长度、隐窝深度比值能高效反映机体的消化吸收能力[37]。潘晓东[38]研究发现，饲喂丁酸梭菌后，肠道绒毛、微绒毛的高度明显增加。郑有秀等[39]发现，丁酸梭菌能够使断奶仔猪的空肠绒毛高度/隐窝深度显著或极显著高于对照组。杨明月等[40]研究丁酸梭菌对獭兔Rex rabbit的肠道性能影响时，发现与对照组相比，试验组中小肠组织绒毛长度极显著或显著升高，试验组十二指肠、空肠及回肠绒毛/隐窝比值不同程度高于对照组。结果表明：丁酸梭菌能够提高肠道对营养吸收作用的机理可能是丁酸梭菌促进了肠道绒毛的发育。

二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）是调节组织（如骨髓和肠粘膜）迅速增殖的一种酶，其功能是将几种多胺氧化脱氨，这是细胞增殖所必需的物质。DAO 主要位于小肠粘膜，特别是在绒毛尖端附近，肠粘膜损害会导致DAO 从小肠绒毛尖端渗入循环系统，因此，DAO 是反映了小肠完整性和成熟度的肠粘膜屏障指标[41]。先前的研究发现，日粮中添加丁酸梭菌可以降低罗非鱼[31]、肉鸡[19]和仔猪[42]血清的DAO 含量。因此，该菌会影响肠道的结构完整性，但作用机制有待进一步研究。

3.4 肠道免疫能力的影响

很多研究证明益生菌可以刺激免疫反应[43]。骨髓分化初级反应蛋白88（MyD88）是Toll 样受体（TLR）信号通路的一个关键接头蛋白，在传递信息和固有免疫中有重要作用，通路对益生菌的识别和肠道免疫系统的激活起着重要作用[44]。丁酸梭菌参与免疫反应需要TLR2 受体的识别，TLR2 常通过MyD88 向核因子κB（NF-κB）发出信号，产生炎症性细胞因子[45]。丁酸梭菌也可在发炎的粘膜中通过TLR2/MyD88 信号通路诱导巨噬细胞产生IL-10，治疗结肠炎[46]。石斑鱼Epinephelus sp.肠道原籍嗜冷杆菌SE6 作为益生菌增加了肠道TLR2 和MyD88的基因表达[44]。Li 等[31]发现，在饲料中补充丁酸梭菌后，罗非鱼肠道中TNF-α 和IL-8 的基因表达增加。Xiao 等[47]研究发现，丁酸梭菌能够降低患有急性胰腺炎的黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco 中IL-8的表达，提高IL-10 的表达。丁酸梭菌可能会促进细胞因子的产生。用乳酸菌Lactobacillus sp.菌株饲喂鲤后促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-12）和抗炎细胞因子（IL-10）基因的表达[48]，提高了虹鳟[49]和石斑鱼[44]肠中IL-8 的基因表达及杂交罗非鱼（Oreochromis niloticus × O.aureus）小肠中TNF-α 的表达[50]。可见，益生菌能够通过增加促炎细胞因子（如IL-8，IL-6 和TNF-α）来诱导宿主的致敏作用；通过合成抗炎细胞因子（如IL-10）为宿主提供有益的作用。

病原微生物可通过多条途径激活补体系统，激活后的补体系统可调节炎症介质的表达，增强机体的免疫能力。鱼类中的补体C3 和C4 在抵抗细菌病原体方面起重要作用。研究表明，益生菌乳酸球菌lactococcus lactis[51]和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）[52]可以提高鱼的血清补体成分水平。Gong 等[53]发现，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus 作为乳酸菌的一种能使草鱼Ctenopharyngodon idella 肝脏和脾脏中IgM和C3 补体蛋白基因的表达升高。在Li 等[31]人的实验中也发现用添加了丁酸梭菌的饲料饲喂罗非鱼，提高了血清中C3 和C4 的浓度。丁酸梭菌及乳酸菌提高补体分子的浓度可能与革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分脂多糖有关[43]。脂多糖能通过替代激活途径激活C3，有助于吞噬细胞对病菌的吞噬，提高免疫系统的保护作用。

丁酸梭菌产生的丁酸对维持结肠上皮的抗氧化能力有重要作用。叶海斌等[54]在虹鳟日粮中添加丁酸梭菌及凝结芽孢杆菌探究益生菌对虹鳟抗氧化能力的影响。结果显示：两种有益菌单一使用或联合使用能有效提高虹鳟血清中总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低丙二醛（MDA）的含量。Hasan 等[55]发现，添加益生菌后，牙鲆SOD 活性升高。同样，益生菌会增加日本鳗Anguilla japonica[56]、红鲷Pagrus major[57]、鲤[58]等体内SOD 和CAT 的活性。这些实验结果表明：丁酸梭菌作为益生菌能够提高水产动物的抗氧化能力，这可能与其产生的丁酸和NADH 等物质有关[59]。

4 丁酸梭菌在水产动物中的使用方法及安全问题

水产动物饲料中添加丁酸梭菌可通过提高肠道性能来维持动物的健康。因此，探究丁酸梭菌的使用方法及最适添加剂量十分重要。经分离得到的丁酸梭菌经过发酵、添加保护剂、喷雾干燥最终制成制剂；在实验研究中，将不同浓度的丁酸梭菌制剂与基础日粮饲料混合后用于饲喂水产动物[60]。在不同种类鱼、虾的实验中，由于发酵技术的限制，多数将丁酸梭菌的浓度梯度设在103～109CFU·g-1之间，少数实验用菌种发酵喷雾干燥后活菌数可达1010CFU·g-1[61]。与未添加丁酸梭菌的对照组相比，多数添加了丁酸梭菌的水产动物生长性能及肠道性能均有所提升，且无副作用，108～109CFU·g-1可作为最适添加量[12,16,32,38]，结合丁酸梭菌在体外的发酵过程，推测高比例的丁酸梭菌在肠道内发酵可能对水产动物有不利影响。高浓度的丁酸梭菌在肠道中发酵时会通过多个途径大量产生丙酮酸、丁酸等酸性物质，降低肠道pH，导致肠道发生酸胁迫现象，反而降低肠道中丁酸梭菌有效活菌数，代谢产物也降低，打破肠道原有的平衡。丁酸梭菌也有可能过度发酵葡萄糖，形成芽孢，进而降低发酵密度[61]。

5 存在问题

5.1 菌株选育

丁酸梭菌分离鉴定操作繁琐，不同厂家选育出的菌株其质量参差不齐，后期菌种发酵获得的产品质量不同，在水产动物中的效果也会有所差异。

5.2 水中可保存性

丁酸梭菌作为水产饲料添加剂，应具备不溶于水且易被肠道吸收的性能。目前最新研究的微胶囊化包囊技术已能解决肠溶性的问题，但丁酸梭菌制剂在水中的有效时限问题还未解决。

5.3 与抗生素或其他菌种联合使用的配比

丁酸梭菌能与多种抗生素联合使用来治疗水产动物的某些肠道疾病，也能与其他益生菌联合使用共同提高水产动物的肠道性能，但丁酸梭菌、抗生素、其他益生菌三者的最佳配比却很少有人研究。

5.4 在水产动物中的使用及肠道作用机制

目前的研究验证了丁酸梭菌对水产动物的有益作用，但对于不同剂量的使用效果研究较少，以后应研究丁酸梭菌在水产动物各个生长阶段的适宜使用剂量。对丁酸梭菌的肠道作用机制研究多倾向于家畜动物，在水产动物中研究较少。丁酸梭菌对水产动物肠道免疫系统的调节作用是否与家畜一致还需进一步验证。

6 展望

丁酸梭菌可抑制嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌等病原菌，可作为添加剂，既能改良水质，也能提高水产动物的抗病能力。与其他研究较多的益生菌（乳酸菌、双歧杆菌等）相比，丁酸梭菌具有芽孢，性能稳定，耐高温，可长期保存，耐酸等优点，可到达水产动物肠道发挥其功能。今后的研究应集中水产动物在不同生长阶段的最佳使用剂量、改良菌株选育技术及提高丁酸梭菌制剂中活菌在水中的存活时间等方面。