盐度对SBR短程硝化系统中硝化细菌的影响*

余志英，龚泽平，王小兰

(广州大学生命科学学院，广东 广州 510006)

由于目前国内外对于高盐渗滤液的研究极少涉及盐度对SBR短程硝化过程中硝化细菌的影响，因此，逐步增加盐度至25 g/L，探究SBR反应器中AOB与NOB在数量与种群多样性的变化，可以为处理高盐渗滤液的短程硝化工艺提供污水可处理盐度参考范围。

1 实 验

1.1 材 料

实验材料取自胡雪柳[11]的SBR短程硝化系统处理模拟垃圾渗滤液过程中的活性污泥。模拟垃圾渗滤液水质情况如表1所示。从初始盐度为5 g/L的垃圾渗滤液中取出的活性污泥作为样品1，逐步提高盐度至25 g/L的垃圾渗滤液中取出的活性污泥作为样品2，均在提高盐度后运行周期的中后期取样。各周期出水的三氮浓度、亚硝化率和氨氮去除率情况如图1所示。

表1 模拟垃圾渗滤液水质Table 1 Water quality of simulated landfill leachate

图1 不同盐度下的出水水质Fig.1 Effluent quality under different salinities

1.2 实验方法

1.2.1 荧光定量PCR法

绝对实时荧光定量PCR法一般是利用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，然后将在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量[12]。本实验将标准品稀释为10-5～10-9五个浓度梯度，然后进行定量PCR，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线[13]。制作标准曲线时质粒拷贝数公式：

C=6.02×1023×C0/M

(1)

式中：C为拷贝数(copies/μL)；C0为质粒浓度(g/mL)；M为含目的基因质粒的分子量(g/mL)。

采用PowerBiofilmTMDNA Isolation Kit试剂盒分别提取2个活性污泥样品总DNA，经梯度PCR，重组DNA的构建，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选鉴定和荧光定量PCR，最后测出2种样品中AOB和NOB的CT值即可计算出拷贝数。

1.2.2 DNA提取与测序

采集样品1和2的活性污泥，使用PowerBiofilmTMDNA Isolation Kit试剂盒提取总的DNA，外加相应引物进行PCR扩增。

AOB-F:5'-GGAGGAAAGTAGGGGATCG-3'

AOB-R:5'-CGTCCTCTCAGACCARCTACTG-3'

NOB-F:TTTTTTGAGATTTGCTAG

NOB-R:CTAAAACTCAAAGGAATTGA。

然后用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA纯化，得到目标AOB和NOB的DNA条带，回收，通过T载体连接、感受态细胞转化，得到AOB与NOB文库。从文库中选取培养成功的菌外加接种到SOC Amp培养基上的菌落送至生工生物公司进行测序。

2 结果与讨论

2.1 盐度(25g/L)对AOB与NOB数量的影响

图2中以红点绘制的AOB标准曲线的方程式为Y=-3.672X+48.705，线性范围为105～109，扩增效率为87.211%，确定系数R2=0.992。

图2 AOB荧光定量PCR标准曲线结果Fig.2 AOB Real-time PCR results

图3中，以红点绘制的NOB标准曲线方程式为Y=-3.876X+48.15，线性范围为105～109，扩增效率为79.881%，确定系数R2=0.982。

图3 NOB荧光定量PCR标准曲线结果Fig.3 NOB Real-time PCR results

处理样品数据，由标准曲线方程计算出拷贝数，整理得表2和图4。发现将垃圾渗滤液中的氯化钠含量由5 g/L经70个周期逐步增加至25 g/L，AOB平均拷贝数下降了57%，而NOB平均拷贝数却提高了3倍。由于拷贝数和菌的数量有直接的关系，所以拷贝数的下降意味着菌种数量的减少。结合张宇坤[9]的研究结果，当盐度突然增加到25 g/L时，AOB的活性降低了68%。可见，在25 g/L的盐度冲击下，AOB的数量与活性都下降了一半以上。

表2 AOB与NOB定量PCR拷贝数Table 2 AOB and NOB Quantitative PCR copy number

图4 AOB与NOB定量PCR结果柱状图Fig.4 AOB and NOB quantitative PCR results histogram

为进一步验证逐步增加盐度对硝化细菌数量的影响，是否能说明SBR反应器中的短程硝化转变为全程硝化，将两个样品的拷贝数进行整理得到图5。多数研究报告指出，全程硝化工艺中AOB与NOB的数量比(A/N)要高于1:2，而要实现短程硝化的稳定进行，其中的A/N就必须接近于1:0[14,17]。结合图5分析可知，低盐环境下的短程硝化过程，AOB从数量上看为优势菌，且NOB数量很少，符合短程硝化NO2--N积累的特点。但AOB与NOB的数量比为87:13，在数量级上A/N并不是很接近1:0。而25 g/L盐度下，AOB数量的下降与NOB数量的上升，使得A/N比变为40.7:59.3，约等于0.69，高于1:2。如此一来，说明在SBR反应器中，硝化细菌的变化可以间接的判断反应器中硝化过程的类型。高盐环境下，短程硝化系统会被破坏，转变为全程硝化。

图5 氯化钠(25 g/L)抑制前与抑制后AOB与NOB在硝化细菌中的占比Fig.5 The proportion of AOB and NOB in nitrifying bacteria before and after inhibition of sodium chloride(25 g/L)

2.2 盐度(25 g/L)对AOB群落结构的影响

图6 样品1测序结果用Neighbour-joint 法构建的系统发育树Fig.6 Sample 1 sequencing results phylogenetic tree constructed with Neighbour-joint

本实验中样品1送样31个，样品2送样31个。测序结果在数据库GenBank 采用BLAST 程序进行同源性检索，把同源性较高的认为是同一种属，如若出现多个相似度高的不同种属，则选其中一种为代表。其中样品1 BLAST结果为14个不同可培养的OTU，样品2结果为15个不同的OUT。在 NCBI 上搜索参考序列，利用软件 MEGA-X 对样品1与样品2的序列进行遗传关系分析，采用Neighbour-joint 法构建系统发育树，如图6，图7所示。

图7 样品2 测序结果用Neighbour-joint 法构建的系统发育树Fig.7 Sample 2 Sequencing results Phylogenetic tree constructed with Neighbour-joint(注：括号里的数字表示为所含序列数，以98%的序列相似性划分菌种，每个菌种随机挑选一条代表序列用于构建AOB序列系统发育树。)(Note:The numbers in parentheses indicate the number of sequences contained,and the strains are divided by 98% sequence similarity.Each strain is randomly selected to represent the phylogenetic tree of AOB sequence.)

根据图6、图7的结果发现，所测样品全部属于变性菌纲(Proteobacteria)的β-亚纲下的亚硝化单胞菌群(Nitrosomonas)。样品1中的8个菌种在样品2中未检测到，推测其为不耐盐菌，因高盐度形成的高渗透压环境，以及高氯离子对微生物产生的毒害作用，微生物的代谢功能与活性受到强烈的抑制，所以在25 g/L的盐度冲击下大量死亡[8]。样品2中新增了8类菌种，但序列数均不超过2，占全部AOB序列的66.7%。这与邹高龙[5]的观点一致，即由于微生物强大的环境适应能力，部分AOB为适应高盐环境，会改变其代谢途径，最终引起菌种的改变。然而，由于AOB平均代时长，缺少由不耐盐菌转变为耐盐菌的缓冲期，使得耐盐菌未能在短时间内成为优势菌，超过半数的不耐盐菌因失水死亡，氨氧化过程受到一定的影响。

2.3 盐度(25 g/L)对NOB群落结构的影响

将测序结果进行整理得到NOB的11类不同序列，位点差异情况如表3所示。

表3 碱基差异位点表Table 3 Base difference locus table

表2表明，送去测序的菌中有62.5%的序列相同，其中差异点主要为35号位点A的嵌入或丢失，少数有差异位点的菌与大多数序列一致的菌差异位点不超过三个，同一个位置的差异位点在其他序列中差异数不超过两个。由此可认为序列中NOB种类可能不是很多，即原来菌群的种类不多。

将序列上传到NCBI的BLAST进行比对并整理，以考察序列的物种名称。由于相似度很高且匹配度与匹配值相同，所以3、4、5 可能有以下两个种类：Nitrobacter sp.strain Nato、Nitrobacter winogradskyi(ATCC 25381)。同理1、2、6、7、8、9、10、11可能有以下四个种类：Nitrobacter sp.NKU、Nitrobacter sp.NBW1、Nitrobacter winogradskyi strain Nb-255和Nitrobacter sp.Strain 311。

图8 Clustalw进化树Fig.8 Clustalw phylogenetic tree

将序列上传到Clustal W进行分析，以分析序列间起源关系，得出图8。根据亲缘关系及相似性，我们将3和5归为Group I；将6、7、8归为Group II；4单独归为Group III；2、11、10归为Group IV；9、1归为Group V。因此，认为加盐抑制后SBR反应器中一共有5种类型的NOB。高盐环境下，NOB数量、种群多样性增加，一定存在Nitrobacter winogradskyi(ATCC 25381)和Nitrobacter sp.strain Nato两种菌，而Nitrobacter sp.NKU、Nitrobacter sp.NBW1、Nitrobacter winogradskyi strain Nb-255和Nitrobacter sp.Strain 311四种菌中一定存在三种。

3 结 论

(1)通过测定样品中AOB与NOB特定基因序列含量，比较低盐度5 g/L与高盐度25 g/L环境下各自拷贝数的差异，发现盐度增加后AOB数量下降了57%，而NOB数量却提高了3倍，硝酸化过程被激活，短程硝化系统被破。

(2)SBR短程硝化系统中优势菌为AOB，逐步增加盐度至25 g/L后则转变为NOB。盐度的增加使得SBR反应器中的短程硝化转变为全程硝化，即可通过硝化细菌数量的变化规律简单判断硝化过程的类型。

(3)NOB与AOB相比，在逐步增加盐度驯化过程中更容易适应高渗环境，出现耐盐菌种。