超声辅助铌酸钾钠压电颗粒抑制乳腺癌的研究

郝 玲，戚穗坚

(华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641)

乳腺癌是女性中的头号杀手，临床上虽然有多种的治疗手段，但大多存在较大的毒副作用[1-3]。例如，传统的化疗对肿瘤组织缺乏选择性，容易对全身正常组织以及免疫功能产生严重损害，并产生肿瘤耐药现象[4]。研究具有低毒副作用并能有效抑制恶性肿瘤的替代手段具有十分重要的意义。对于某些恶性肿瘤的治疗，肿瘤治疗电场成了一种新的选择[5-6]。但这种治疗一般需使用外加电源，不仅使用不方便，而且还因插入电极而带来组织损伤。铌酸钾钠(KNN)是典型的无铅压电材料，具有优越的压电常数(较大的d33值)和较高的居里温度，它能在远程超声作用下产生内在电场进而作用细胞调控其行为[7-8]。研究其产生的内在电场对恶性肿瘤的潜在抑制作用可望为癌症的治疗提供方便有效、低毒副作用的替代方案。本文通过水热合成法制备了尺寸及电学特征可控的压电铌酸钾钠颗粒(P-KNN)，对其进行了结构表征，研究了在超声辅助下其生物相容性以及对两种不同乳腺癌细胞的抑制作用。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

无水乙醇，五氧化二铌，碳酸钾，碳酸钠，CCK-8及细胞活死染色试剂盒；

球磨机，烘箱，马弗炉，高压反应釜，离心机，超声机，酶标仪。

1.2 样品制备

通过水热合成法制备P-KNN[9]。具体如下，以200 mL无水乙醇预先混合五氧化二铌34.262 g，碳酸钾6.831 g和碳酸钠8.907 g，进行球磨8 h。将球磨所得的混合液取出置于80 ℃烘箱至完全烘干(一般为12 h)。烘干后的样品转移至坩埚，放入马弗炉中以750 ℃煅烧2 h，制得粉体；取出0.02 mol的粉体与50 mL去离子水进行共混后转移至100 mL聚四氟乙烯密封的高压反应釜中，于210 ℃下反应24 h后，取出静置12 h；弃上清，沉淀物搅拌混匀后转移至离心管中，8000 rpm的转速下离心20 min；将上清液倒掉后加入30 mL的无水乙醇，将离心管密封好后放入超声机中分散10 min，随后将其放入离心机中以同样的条件进行再次离心。离心后，倒掉上层无水乙醇后加入去离子水清洗两次；将清洗后的样品放入80 ℃烘箱烘干，制备出P-KNN。

分别以扫描电子显微镜(SEM)、能谱仪(EDS)、粒度分析仪、X射线衍射分析仪(XRD)和拉曼图谱(Raman)分别对材料的表面形貌、元素组成、粒径分析、物相分析和化学结构进行分析。

1.3 细胞实验

实验选用三种细胞株：具有高转移性的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231；低转移性乳腺癌细胞株MCF-7以及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A。每种细胞在各自官方推荐的最佳培养条件下培养。采用CCK-8试剂以及细胞死活染色法研究材料对正常乳腺上皮细胞的生物相容性以及对乳腺癌细胞的细胞毒性。具体如下，将细胞接种于孔板中，待细胞完全贴附后分别与200，400 μg/mL的材料溶液共培养；超声组每隔12 h超声处理2 min，并于材料加入后24 h，36 h，48 h分别以CCK-8试剂盒进行检测，计算细胞存活率。另外，在材料加入24 h后以试剂盒进行死/活染色，于倒置荧光显微镜下进行观察，在同一位置同时观察发绿色荧光的活细胞与红色荧光的死细胞并进行拍照，采用Image J软件进行处理。用transwell试验检测材料对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响，通过倒置荧光显微镜明场观察transwell小室下层过膜的细胞数量并进行拍照。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征分析

通过XRD分析材料的晶体结构，如图1(a)所示，表明制得的材料为ABO3型钙钛矿结构，在45度角附近出现(002)与(200)双峰，表明四方相与正交相共存，制备的颗粒具有良好的压电性。利用Raman分析材料的化学结构，在265 cm-1位置及621 cm-1位置均有KNN特征振动峰的出现(图1(b))。EDS分析表明材料的主要成分为氧、钠、铌、钾元素(图1(c))。

图1 P-KNN的XRD(a)，Raman(b)和EDS(c)Fig.1 XRD(a),Raman(b)and EDS(c)of P-KNN

图2 P-KNN的SEM(a)和纳米粒度(b)分析Fig.2 SEM image(a)and DLS analysis(b)of P-KNN

利用SEM对材料的形貌进行观察，如图2(a)所示，P-KNN呈现颗粒状，材料具有较好的分散性，大小均一。进一步通过粒径分析表明P-KNN颗粒的大小约457.4 nm(图2(b))，分布系数(PDI)为0.422，表明样品的粒径分布较窄，具有良好的分散性。

综上表明，水热合成法成功制备具有压电特性的P-KNN，具有微纳米级的粒径大小且具有良好的分散性。

2.2 材料对乳腺癌细胞的抑制作用

采用CCK-8活性检测法在材料加入后24 h，48 h，72 h进行2种不同转移能力的乳腺癌细胞活性的检测。由图3(a)可见，在不施加超声下，与对照组相比，浓度为200，400 μg/mL的P-KNN对MDA-MB-231的存活率均具有一定的抑制作用；在施加超声下，MDA-MB-231细胞的存活率进一步明显受到抑制，在24 h时，400 μg/mL的P-KNN下MDA-MB-231的存活率仅约30%。当对MDA-MB-231细胞继续培养至48 h，72 h，结果表明，每个组别的细胞存活率都得到进一步的抑制。材料以及超声处理对MCF-7细胞存活率的影响与MDA-MB-231细胞的结果呈现相似的趋势(图3(b))。CCK-8实验表明P-KNN的作用以及超声的刺激都能明显的对两种乳腺癌细胞进行抑制，且在P-KNN浓度为400 μg/mL并加超声处理时对乳腺癌细胞的抑制作用最强。

图3 施加/不施加超声下不同浓度P-KNN对MDA-MB-231(a)与MCF-7(b)细胞的毒性作用Fig.3 Cytotoxic effects of different concentrations of P-KNN on MDA-MB-231(a)and MCF-7(b)w/o ultrasound

进一步采用细胞死活染色考察材料以及超声作用对MDA-MB-231和 MCF-7细胞的抑制作用。超声组在材料加入12 h后进行超声处理，24 h后对细胞进行死活染色，活细胞呈现绿色的荧光而死细胞呈现红色的荧光。结果显示(此处未附上显色图)，对于两种乳腺癌细胞，在不加材料不加超声处理的空白对照组，细胞均为活细胞(绿色荧光)。在不施加超声下，当细胞与400 μg/mL的P-KNN作用后，死细胞(红色荧光)出现；进一步施加超声下，大量的死细胞出现。综上表明，在超声辅助下，材料能够产生非常显著的乳腺癌细胞抑制效果，此结果也与上述CCK-8实验的结果一致。

2.3 材料对乳腺癌细胞的迁移侵袭能力的影响

Transwell试验结果表明(图4)，超声的刺激与P-KNN材料的作用都能够对乳腺癌细胞的迁移侵袭能力产生显著的抑制作用。在超声的辅助下(P-KNN-400+US组)，材料的作用能够完全抑制MDA-MB-231和 MCF-7两种乳腺癌细胞的运动，原因可能是由于一方面材料和超声的同时作用造成了癌细胞的大量死亡，另一方面存活的细胞由于其本身的形态已经发生严重的改变甚至破坏，细胞也基本丧失了运动的能力。

图4 施加/不施加超声下400 μg/mL P-KNN对MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移侵袭实验Fig.4 The migration and invasion assays of MDA-MB-231 and MCF-7 co-cultured with 400 μg/mL P-KNN w/o ultrasound

2.4 材料的生物相容性

CCK-8活性检测的结果表明(图5)，在不施加超声下，正常乳腺细胞MCF-10A与不同浓度的P-KNN溶液共培养后48 h后，细胞的存活率均在93%以上，表明KNN具有良好的生物相容性。而在施加超声下(+US)，细胞的存活率虽有一定降低，但MCF-10A的细胞存活率仍能达到75%以上，表明KNN对正常乳腺细胞毒性作用较低。

图5 施加/不施加超声下不同浓度P-KNN对MCF-10A细胞的细胞毒性作用Fig.5 Cytotoxic effects of different concentrations of P-KNN on MCF-10A w/o ultrasound

细胞死活染色(此处未附上显色图)结果与CCK-8定量结果一致，在不施加超声下，与不同浓度的P-KNN共培养后MCF-10A显示良好的细胞活性，出现很少死细胞(红色荧光)；在施加超声下，仅有少量红色的死细胞出现。综上结果说明P-KNN具有良好的生物相容性，施加超声刺激会造成细胞的少量死亡，但对比以上实验结果，在具有显著乳腺癌细胞抑制作用的P-KNN-400+US组，正常乳腺上皮细胞的存活率仍然能够达到75%以上。

3 结 论

本研究制备具有压电性能的铌酸钾钠颗粒，研究其在超声辅助下在体外抑制乳腺癌细胞增殖与迁移的潜在能力。通过对样品的形貌、物相、化学结构等的分析，证实获得了分散性良好、尺寸均一的压电性铌酸钾钠颗粒(P-KNN)；通过细胞的活性检测表明，400 μg/mL P-KNN在超声的辅助作用下能够达到对两种不同乳腺癌细胞高达70%左右的抑制作用，对这两种乳腺癌细胞的迁移侵袭具有明显的抑制作用。而另一方面，材料以及超声的作用并没有给正常乳腺上皮细胞带来明显的毒性作用。此研究为进一步研究具有压电性能的生物相容性材料用于癌症治疗提供了重要的实验基础。