香菇菌株LE08液体发酵及多糖提取工艺的优化

黄蓓蓓，王永志

(1.河南科技大学 应用工程学院 食品工程系， 河南 三门峡 472000；2.三门峡职业技术学院 食品园林学院，河南 三门峡 472000)

1 概述

香菇[Lentinulaedodes(Berk.)Pegler]，隶属于多孔菌科(Polyporaceae)、香菇属(Lentinula)[1]。香菇的肉质鲜美、味道独特，具有较高的食用和药用价值。目前香菇鲜品、干品、酱料已经成为人们日常生活中不可缺少的烹饪用料[2-4]。我国是较早进行香菇人工栽培的国家[5]。香菇的营养丰富，富含多种氨基酸、维生素和矿物质。除此之外，香菇还含有极高的不饱和脂肪酸、麦角甾醇、菌甾醇、香菇肽和酪氨酸氧化酶。麦角甾醇可转化为维生素D，能增强人体机能；而香菇肽和酪氨酸氧化酶可起到降血压的作用。研究表明，香菇中的活性物质多糖能改善机体代谢、调节免疫、抗肿瘤、增强免疫能力、抗衰老和抗氧化[6]。

有关香菇液体发酵的研究主要集中于对发酵培养基的成分和培养条件的优化问题上，大多报道多以香菇菌丝体的生物量为指标[7-13]。韩冰等通过探究香菇菌株辽香6号的最佳液体深层发酵实验，发现最佳的发酵培养基为：红糖1%、玉米粉2%、酵母粉1%、麸皮2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%[14]。李春霞等以香菇0912号为供试菌株，探究不同养分和条件下对菌丝体干质量的影响，结果表明影响香菇菌丝干质量的因素为葡萄糖、玉米浆、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾[15-16]。

传统香菇多糖的提取是从子实体中获得的，然而香菇子实体的生长周期较长，受季节和环境的限制，其生产效率较低[17-19]。香菇液体发酵技术具有周期短、成本低、产量大、可工业化生产等特点[20]。目前对于香菇液体发酵条件的研究仍不够深入，液体发酵所得的多糖产量普遍不高[21-23]。不同产区的香菇菌种，其液体发酵的条件也不尽相同[24]，本文通过对香菇液体发酵的培养基进行优化，同时也对发酵液中多糖提取的工艺进行了探究，为香菇液体发酵的工厂化生产奠定了一定的基础[25]。

2 材料与方法

2.1 实验菌种

香菇菌株LE08为本实验室自行分离于野生香菇子实体而得，菌株保藏于本实验室。

2.2 实验试剂

玉米粉、单糖、麦麸、酵母膏、多糖、硫酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸二氢钠和硝酸铵。

2.3 实验仪器

培养箱、无菌工作台、灭菌锅、500 mL三角瓶、摇床、1000 mL烧杯、注射器、天平、离心机和pH计。

2.4 培养基

2.4.1 基础培养基

土豆培养基：土豆20 g，糖2.0 g，琼脂1.8 g，纯净水1000 mL。

2.4.2 种子培养基

土豆20 g，糖2.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，纯净水1000 mL。

2.4.3 发酵培养基

葡萄糖2.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸二氢钾0.5 g，无菌水1000 mL。

2.5 实验方法

2.5.1 香菇菌种活化

在超净工作台内，用无菌接种铲从香菇菌株LE08的母管斜面试管内取1 cm3的菌块，接种于PDA上，并在25 ℃培养箱中培养7 d，定时观察菌丝的生长状态，待菌丝长满试管后，便可进行后续实验。

2.5.2 摇瓶种子液和香菇发酵液的制备

在超净工作台中，用无菌接种铲从已活化的菌株LE08的PDA斜面试管中铲取6块大小为1 cm3的菌块，分别接种于装有100 mL种子液体培养基的三角瓶中，每瓶3块菌块。将接种好的三角瓶放置于摇床中，温度调整为25 ℃，转速为160 r/min，培养7～10 d。

LE08菌株的液体菌种制作结束后，在无菌工作台中，将种子液转接于液体发酵的三角瓶中，装液量共为100 mL。将接种好的三角瓶置于摇床中，温度为25 ℃，转速为180 r/min，培养至发酵终点。

2.5.3 最佳碳源、氮源和无机盐筛选

供试碳源为玉米粉、麦芽糖、葡萄糖和蔗糖；碳源筛选培养基：蛋白胨1.5%、碳源2.0%和磷酸二氢钾0.06%。

供试氮源为硝酸铵、麦麸、蛋白胨和酵母膏；氮源筛选培养基：葡萄糖2.0%、氮源1.5%和磷酸二氢钾0.06%。

供试无机盐为硫酸镁、硫酸钙、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠；无机盐筛选培养基：无机盐0.06%、葡萄糖2.0%和蛋白胨1.5%。

按照上述配方，分别配制用于筛选碳源、氮源和无机盐的发酵液，接种已培养好的香菇种子液10 mL，培养至发酵终点后分别测定不同碳源、氮源和无机盐对香菇发酵液中多糖产量的影响。

2.5.4 正交实验设计

本文筛选对香菇发酵液中多糖产量影响较大的因子：蛋白胨、葡萄糖和磷酸二氢钾，进行三水平三因素的正交实验，见表1。

表1 正交实验因素以及水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2.5.5 醇沉法提取发酵液中的多糖

按照已经筛选出的最佳碳源、氮源和无机盐配方，配制香菇液体发酵液，方法参考2.5.2。将充分发酵的液体离心处理，取上清液，再经0.20 μm滤膜过滤，放置于4 ℃保存，备用。

2.5.6 乙醇加入量对香菇液体发酵液中多糖提取的影响

取50 mL上述制备好的香菇发酵液于烧杯中，调节pH值为7，分别按照表2的体积比例加入无水乙醇。在室温条件下放置24 h，离心并收集沉淀，干燥后称重，计算香菇发酵液中的多糖含量。

表2 醇沉法提取多糖中无水乙醇的添加量Table 2 The additive amount of absolute ethanol in polysaccharide extracted by alcohol precipitation method mL

2.5.7 醇沉时间对香菇液体发酵液中多糖提取的影响

取50 mL香菇发酵液于烧杯中，调节pH值为7，添加无水乙醇150 mL。在室温条件下，分别静置12，24，36 h后经离心收集沉淀，干燥、称重、计算香菇发酵液中的多糖含量。

3 结果与分析

3.1 不同碳源对香菇液体发酵的影响

图1 不同碳源对香菇发酵液中多糖产量的影响Fig.1 The effect of different carbon sources on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

本研究为考察不同碳源对香菇液体发酵的影响，选取4种碳源，分别为麦芽糖、玉米粉、蔗糖和葡萄糖，其添加浓度均为2.0%。由图1可知，碳源的种类不同，香菇发酵液中香菇多糖产量也不相同。当以葡萄糖为碳源时，香菇发酵液所产的香菇多糖量最高，达1.31 g/L,其次是蔗糖和麦芽糖，多糖产量最低的碳源为玉米粉。由此说明葡萄糖为香菇液体发酵的最适宜碳源。

3.2 不同氮源对香菇液体发酵的影响

图2 不同氮源对香菇发酵液中多糖产量的影响Fig.2 The effect of different nitrogen sources on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

本实验选取了4类氮源麦麸、硝酸铵、蛋白胨、酵母膏，添加浓度均为1.0%。探究在不同氮源条件下，香菇液体发酵液中多糖产量的变化。麦麸、蛋白胨和酵母膏为有机氮源，硝酸铵为无机氮源。由图2可知，使用有机氮源(麦麸、蛋白胨和酵母膏)时，香菇发酵液中的多糖含量较高，其中以蛋白胨为氮源时，香菇发酵液中的多糖产量最高，为1.49 g/L；以硝酸铵为氮源时，香菇发酵液中的多糖产量仅为0.54 g/L。由此表明香菇液体发酵的最适氮源为蛋白胨。

3.3 不同无机盐对香菇液体发酵的影响

图3 不同无机盐对香菇发酵液中多糖产量的影响Fig.3 The effect of different inorganic salts on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

3种无机盐硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸钙的添加浓度均为0.06%。由图3可知，以磷酸二氢钾为无机盐时，香菇液体发酵液中的多糖含量最高，多糖产量高达1.31 g/L，说明磷酸二氢钾对香菇多糖的合成具有促进作用。

3.4 正交实验结果

由上述单因素实验结果可知，适合香菇液体发酵的最佳碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、蛋白胨和磷酸二氢钾。在此条件下，按照表1进行三因素三水平的正交实验，结果见表3。

表3 葡萄糖、蛋白胨和磷酸二氢钾三因素三水平的正交实验结果Table 3 Three-factor and three-level orthogonal experimental results of glucose, peptone and monopotassium phosphate

由表3可知，A2B2C3组合的结果最好，并且蛋白胨对香菇液体发酵多糖产量的影响最大，磷酸二氢钾次之，葡萄糖的影响最小。确定香菇液体发酵培养基的组成为：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、磷酸二氢钾0.07%。在此条件下，香菇液体发酵多糖的产量为1.68 g/L。

3.5 无水乙醇加入量对香菇发酵液中多糖提取量的影响

图4 乙醇的添加量对香菇发酵液中多糖提取量的影响Fig.4 The effect of ethanol additive amount on the extraction yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

由图4可知，当无水乙醇的添加量小于或等于150 mL时，香菇液体发酵液中的多糖提取量随着乙醇添加量的增大而增大；当无水乙醇的添加量大于150 mL时，其多糖提取量随着乙醇添加量的增大而逐渐下降。当乙醇添加量与发酵液量的体积比为3∶1时，本文中乙醇的添加量为150 mL，发酵液量为50 mL，香菇液体发酵液中的多糖提取量最高，达1.56 g/L。

3.6 醇沉时间对香菇发酵液中多糖提取量的影响

图5 醇沉时间对香菇发酵液中多糖提取量的影响Fig.5 The effect of alcohol precipitation time on the extraction yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

由图5可知，醇沉时间在24 h时，香菇菌株LE08的发酵液中多糖的提取量最高，为1.61 g/L，而醇沉时间大于24 h时，其多糖提取量并无显著性增加，因此醇沉法中最佳醇沉时间为24 h。由于本实验选取的时间周期较大，因此不能确定在醇沉12 h和24 h之间的多糖含量变化，后续实验可有针对性地探究最佳的醇沉时间，以确保减少醇沉时间。

4 结论

本文初步研究了适合香菇LE08号菌株的液体发酵培养基以及提取发酵液中多糖成分的最佳醇沉工艺。通过单因素和正交实验，确定了发酵液中的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，最佳无机盐是磷酸二氢钾。最佳培养基制作方案为：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.5%、磷酸二氢钾0.07%时，此时香菇液体发酵多糖的产量最高。在探究醇沉法提取香菇发酵液中的多糖工艺时，确定了最佳的无水乙醇添加量为发酵液体积的3倍，醇沉时间为24 h。后续的实验可集中于不同提取方法对香菇发酵液中多糖活性的影响，为香菇液体发酵的工厂化应用提供了理论依据。