壳聚糖对PM2.5所致小鼠急性肺损伤的干预作用

熊程赵英政陶映君徐光翠

(新乡医学院公共卫生学院,河南 新乡 453003)

近年来,以PM2.5浓度严重超标为特征的雾霾污染仍是空气污染的主要原因。PM2.5是空气动力学直径≤2.5μm的悬浮细颗粒物,高浓度PM2.5是雾霾的主要成因。我国PM2.5的高排放与我国经济的快速发展、产业和能源结构的不合理、城市化进程的加速以及汽车保有量的快速上升等因素有关。因此,治理PM2.5污染将是一项长期而又困难的工作,这就意味着我国大多数城市居民在未来相当长的时间内都将生活在PM2.5超标的环境中。据估计,在全世界范围内,每年空气污染暴露造成约700万人过早死亡,3%的伤残调整生命年减少[1]。PM2.5由于其形状不规则、粒径小,可以直接进入肺泡,并在大气中悬浮时间较长,能够吸附大量毒性化合物等诸多特点,会对人体造成严重危害。空气中PM2.5的浓度与呼吸系统疾病、哮喘等的发病率、死亡率有紧密的联系[2-3]。PM2.5容易滞留在终末细支气管和肺泡中,从而刺激机体肺部或全身发生炎症和氧化应激,造成肺部损伤[4]。

虽然我国颁布了一系列控制空气污染的法规,这势必会导致PM2.5水平在今后会急剧减少。但目前人们仍然暴露于较高的空气污染水平,而且比目前环保部门规定的标准要高许多倍。如果膳食补充剂或药物制剂可以减轻空气污染对健康的不利影响,那么居住生活在空气高污染地区的民众其健康可能会得到一定程度的保护。壳聚糖(chitosan,CTS)是甲壳素脱乙酰基后的降解产物,是自然界中唯一大量存在的碱性氨基多糖。研究表明,壳聚糖具有清除自由基、保护机体免受过氧化损伤、调节血脂、保护肝、进行免疫调节等功能[5-6]。本研究采用动物试验,小鼠提前2周摄入一定剂量壳聚糖,之后气管滴注PM2.5,评估短期PM2.5重复暴露对成年小鼠的肺健康效应,探讨小鼠补充壳聚糖后是否可以减轻PM2.5暴露所致急性肺损伤的影响。这一研究结果将为减轻空气污染对大众健康的一种保护机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

44只8周龄健康SPF级雄性C57BL/6J小鼠,体重19～26 g,从北京维通利华有限公司购买【SCXK(京)2016-0002】,饲养于新乡医学院公共卫生学院具有独立通风笼盒(IVC)的实验动物房【SYXK(豫)2016-0006】。1周适应期后,随机分为4组,即对照组、PM2.5组、壳聚糖组及壳聚糖+PM2.5组,每组11只。壳聚糖组及壳聚糖+PM2.5组动物提前2周灌胃壳聚糖,剂量为200 mg/kg,采用等容量灌胃法(0.2 mL/10 g BW),对照组和PM2.5组灌胃相同剂量蒸馏水,每天1次,持续2周。PM2.5后,PM2.5组、壳聚糖+PM2.5组小鼠气管滴注PM2.5(4 mg/kg),对照组和壳聚糖组气管滴注0.9%生理盐水(saline),每天1次,连续7 d。动物自由摄食(上海斯莱康SPF级小鼠专用饲料)、饮水,室温20℃～25℃,相对湿度60%～70%,昼夜明暗交替时间12 h/12 h。所有操作均符合新乡医学院伦理委员会伦理学要求(审批号:XYLL-2017086)。

1.1.2 主要试剂与仪器

水溶性壳聚糖购自上海源叶生物科技有限公司;总蛋白(total protein,TP)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等检测试剂购自南京建成生物技术有限公司(批号分别为A045-3-2、A020-1-2、A003-1-2);白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等试剂盒均由北京索莱宝科技有限公司提供(批号分别为SEKM-0002、SEKM-0046、SEKM-0034);TE-6070 PM2.5大流量采样器(美国TISCH公司),酶标仪(美国Thermo公司),电子精密天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司),超声波清洗机(郑州生元仪器有限公司),冷冻干燥器(北京亚星仪科有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5采样

选取新乡医学院科技楼七楼楼顶(北纬N35°17′11.17″、东经E113°55′59.12″)作为采样点。将石英膜置于TISCH大流量颗粒物采样器进行采样。将采样膜剪成约4 cm×4 cm的正方形置于培养皿,加入适量的超纯水。利用KQ-500E型超声波震荡仪震荡培养皿,冷冻干燥法采集培养皿内的PM2.5。

1.2.2 动物处理与样本采集

末次染毒24 h后,称重,用4%异氟烷麻醉动物,股动脉取血。处死动物,分离肾及肝并称重,计算脏器系数:脏器质量(g)/体重(100 g),分离血清。结扎右肺,取右肺下叶,多聚甲醛固定,苏木精-伊红(HE)染色。用预冷的PBS灌洗左肺,收集BALF。采用Bradford法测定TP和MDA含量;利用分光光度法测定LDH活性;ELISA法测定TNF-α、IL-1β和IL-8等炎性因子水平。

1.3 统计学分析

计量资料以平均值±标准差(±s)表示。采用SPSS 21.0统计软件分析,对正态分布资料,多组间均数比较采用单因素方差分析;若方差齐,两两比较采用LSD检验;若方差不齐,采用Dunnet T3检验。对非正态分布资料,多组间均数比较采用非参数检验——秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。用GraghPad Prism 8.0绘制统计分析图。

2 结果

2.1 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠体重、脏器质量及其脏器系数的影响

以体重、肝重、肾重及其脏器系数作为测量指标进行单因素方差分析。与对照组比,PM2.5组小鼠体重、肝重、肾重及其脏器系数明显降低,具有统计学意义(P＜0.05);壳聚糖组体重、肝重、肾重及其脏器系数与对照组比无明显差异(P＞0.05)。当小鼠提前摄入一定剂量的壳聚糖,2周后暴露PM2.5,与不摄入壳聚糖的PM2.5组比,壳聚糖+PM2.5组小鼠体重、肝重和肝脏器系数均有所升高,具有统计学意义(P＜0.05),但肾及其脏器系数无明显差异(P＞0.05);与壳聚糖组比,壳聚糖+PM2.5组肝重降低,具有统计学意义(P＜0.05)(见表1)。

表1 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠体重、脏器质量及其脏器系数的影响(±s,n=11)Table 1 Effects of chitosan on body weight,organ mass and organ coefficient of mice exposed to PM2.5(±s,n=11)

表1 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠体重、脏器质量及其脏器系数的影响(±s,n=11)Table 1 Effects of chitosan on body weight,organ mass and organ coefficient of mice exposed to PM2.5(±s,n=11)

注:与对照组比较,#P＜0.05;与PM2.5组比较,*P＜0.05;与壳聚糖组比较,△P＜0.05。Note.Compared with the control group,#P＜0.05.Compared with PM2.5 group,*P＜0.05.Compared with chitosan group,△P＜0.05.

组别Groups体重(g)Weight(g)肝重(g)Liver weight(g)肝系数(g/100 g)Liver coefficient(g/100 g)肾重(g)Kidney weight(g)肾系数Kidney coefficient(g/100 g)对照组Control group 22.88±2.24 1.20±0.18 5.88±0.85 0.27±0.04 1.28±0.11 PM2.5组PM2.5 group 19.07±1.58# 0.83±0.11# 4.33±0.31# 0.23±0.03# 1.12±0.07#壳聚糖组Chitosan group 22.85±2.05 1.17±0.14 5.89±0.93 0.27±0.02 1.24±0.06壳聚糖+PM2.5组Chitosan+PM2.5 group 21.18±1.28* 1.06±0.12*△ 5.03±0.67* 0.25±0.02 1.18±0.07

2.2 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠肺HE染色结果比较

对照组和壳聚糖组小鼠肺组织未见明显异常。与对照组比较,PM2.5组肺泡间隔显著增宽,出现炎症,其内有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润;与PM2.5组比较,壳聚糖+PM2.5组肺间隔明显变窄,其内淋巴细胞、浆细胞浸润明显减少(见图1)。

图1 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠肺HE染色比较Figure 1 Comparison of HE staining of PM2.5 exposed mice lung with chitosan

2.3 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠BALF中TP和LDH的影响

以TP和LDH作为测量指标进行单因素方差分析。与对照组比较,PM2.5组小鼠BALF中TP和LDH的含量明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05);壳聚糖组小鼠BALF中TP和LDH含量与对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)。当小鼠提前摄入一定剂量的壳聚糖,2周后暴露PM2.5,与没有摄入壳聚糖的PM2.5组小鼠比较,壳聚糖+PM2.5组小鼠BALF中TP和LDH的含量明显下降,具有统计学意义(P＜0.05);与壳聚糖组比较,壳聚糖+PM2.5组小鼠BALF中TP和LDH的含量有所升高,具有统计学意义(P＜0.05)(见图2)。

图2 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠BALF中TP和LDH的影响Figure 2 Effect of chitosan on TP and LDH in BALF of mice exposed to PM2.5

2.4 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠肝MDA的影响

以MDA作为测量指标进行单因素方差分析。与对照组比较,PM2.5组小鼠肝中MDA含量明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05);壳聚糖组小鼠肝中MDA含量与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。与PM2.5组比较,壳聚糖+PM2.5组小鼠肝MDA含量明显下降,具有统计学意义(P＜0.05);与壳聚糖组比较,壳聚糖+PM2.5组肝中MDA含量有所升高(P＜0.05)(见图3)。

图3 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠肝MDA的影响Figure 3 Effect of chitosan on MDA in liver of mice exposed to PM2.5

2.5 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠BALF及血清中炎性因子的影响

以IL-1β、IL-8和TNF-α作为测量指标进行单因素方差分析。从图4可见知,与对照组比较,PM2.5组小鼠BALF(图4A,4B,4C)和血清中(图4D,4E,4F)炎性因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平明显升高,具有统计学意义(P＜0.05);壳聚糖组小鼠BALF和血清中IL-1β、IL-8和TNF-α表达水平与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。与PM2.5组比较,壳聚糖+PM2.5组小鼠BALF和血清中IL-1β、IL-8和TNF-α明显减少,具有统计学意义(P＜0.05);与壳聚糖组比较,壳聚糖+PM2.5组BALF及血清中IL-1β水平有所升高(P＜0.05),但IL-8和TNF-α均无显著性差异(P＞0.05)。

图4 壳聚糖对PM2.5暴露小鼠BALF和血清炎性因子的影响Figure 4 Effects of chitosan on BALF and serum inflammatory factors in mice exposed to PM2.5

3 讨论

PM2.5暴露对小鼠有肺损伤,影响小鼠BALF中TP和LDH,肝MDA,BALF及血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平。提前摄入一定剂量的壳聚糖对PM2.5所致肺损伤有一定的干预作用,主要从抑制氧化应激和改善肺部炎症反应等方面促进损伤修复。

本研究采用动物实验,通过气管滴注法使小鼠暴露PM2.5,评估PM2.5短期重复剂量暴露是否对小鼠造成急性肺损伤,并给动物提前补充壳聚糖,观察壳聚糖是否可以减轻PM2.5暴露所致的毒效应。结果显示,与对照组比较,小鼠暴露PM2.5后,小鼠体重、肝重、肾重以及脏器系数明显下降,这与李星辉等[7]研究结果一致。提示短期重复剂量PM2.5暴露对机体有一定的毒效应。当小鼠提前摄入一定剂量的壳聚糖,2周后暴露PM2.5,与没有摄入壳聚糖的PM2.5组小鼠比较,壳聚糖+PM2.5组小鼠体重、肝重和肝脏器系数均有所升高。提示动物提前补充壳聚糖对PM2.5所致的损伤有一定的缓解作用。可能与PM2.5激发的氧化应激有关,壳聚糖具有清除自由基、保护机体免受过氧化损伤等作用[5],动物提前摄入壳聚糖可能保护线粒体免受氧化应激,从而维系了相对正常三羧酸循环和代谢水平。

小鼠肺切片显示,PM2.5染毒后肺泡间隔显著增宽,出现明显的炎症改变,而壳聚糖在一定程度上能抑制肺部的炎性作用;与PM2.5组比较,壳聚糖+PM2.5组肺间隔明显变窄,其内淋巴细胞、浆细胞浸润明显减少。上述结果与文献报道的其它抗氧化剂的干预效果一致[8-9]。

PM2.5诱导的氧化应激在颗粒污染物所致呼吸系统急性效应中发挥重要作用[10-11]。MDA是脂质过氧化作用的最终产物,也是机体氧化损伤的主要标志物。MDA含量的测定可以直接反映机体受到氧化损伤的程度[12-13],其容易引起细胞膜发生脂质过氧化损伤,导致膜的功能损伤或丧失,进而使得细胞内LDH和TP漏出[14]。LDH是反映细胞膜损伤的早期敏感指标,是细胞毒性的标志物;TP是反应肺部血管通透性的指标,TP水平可反映肺泡上皮-毛细血管屏障损伤程度[15]。本研究发现,染毒后肺泡灌洗液中的LDH、TP和肝中MDA明显升高,而提前摄入一定剂量的壳聚糖后,以上指标不同程度降低,由此可推测PM2.5可使机体产生氧化应激,导致细胞膜的完整性发生改变,影响肺部血管通透性;而壳聚糖具有的抗氧化功效可减轻由PM2.5造成的氧化损伤,这与其它文献的研究结果基本一致[5]。

PM2.5能够诱发肺部炎症,促进呼吸道细胞释放炎症介质如IL-8及TNF-α等[16-17]。TNF-α是生物体内主要的促炎因子和免疫调节因子,主要由单核巨噬细胞产生,参与机体的急、慢性炎症过程[18]。研究发现壳聚糖能增强静息中性粒细胞的活性,抑制中性粒细胞的过度活化、细胞中IL-8和TNF-α的分泌[19-21]。本研究发现小鼠暴露PM2.5,其BALF及血清中TNF-α、IL-1β和IL-8水平明显升高,提前摄入一定剂量的壳聚糖能降低其表达,对TNF-α和IL-8的抑制作用尤为明显,因此提示壳聚糖通过对促炎因子表达的抑制作用可缓解PM2.5诱发的肺部炎症反应,改善炎症反应所致肺损伤[22-23]。