头穴丛刺抑制海马β-APP表达改善阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力研究*

王春霞，谷栩萌，孙兴华，武文鹏,2△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是临床常见的神经系统变性病，是痴呆最常见的原因，约占痴呆全部类型的60%～70%[1-2]。痴呆已成为全球老年人残疾和依赖他人的最主要原因，是一个迅速加剧的公共卫生问题，给患者家庭及其照料者、社会带来沉重负担[3-7]。目前，已被批准上市的药物只能减缓阿尔茨海默病的临床症状，而无法完全治愈该疾病[8-10]。因此，探讨阿尔茨海默病的相关致病机制及防治手段是近十年医学界关注的重点和热点。淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)是一种广泛存在于多种组织细胞膜上的跨膜蛋白，通过降解可生产β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)，具有参与中枢神经系统免疫反应等多种功能[11-12]。β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)的翻译后修饰异常被认为是影响APP代谢所致Aβ沉积病理过程的重要环节[13]。研究表明，针刺在阿尔茨海默病的防治中发挥着重要作用，并被广泛应用于临床[14-17]。本研究观察头穴丛刺对阿尔茨海默病模型大鼠空间记忆及海马区β-APP的表达影响，以期为针刺防治阿尔茨海默病提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)；大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)；徕卡RM2135型切片机(德国Leica)；Moticam3000显微摄影成像系统(美国Motic公司)；超速冷冻离心机(型号：H-2050R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；荧光定量PCR仪(型号：Exicycler 96，韩国BIONEER公司)；LKB-V型超薄切片机(瑞士BROMMA公司)；Motic Med 6.0病理图像分析系统(美国Motic)；淀粉样β蛋白片段1-42(批号：MB3894，大连美伦生物技术有限公司)；β-APP ELISA试剂盒(货号：TWp027502，上海通蔚生物公司)；兔抗多克隆一抗(北京博奥森生物技术有限公司)；兔抗多克隆二抗PV6001(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TRIpure(货号：RP1001，北京百泰克生物技术有限公司)；Super M-MLV 反转录酶(货号：PR6502，北京百泰克生物技术有限公司)；RNase inhi-bitor(货号：RP5602，北京百泰克生物技术有限公司)；2×Power Taq PCR MasterMix(货号：PR1702，北京百泰克生物技术有限公司)；SYBR Green(货号：SY1020，北京百泰克生物技术有限公司)。

1.2 实验动物与分组

1.2.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠70只，雄性，3月龄，体质量(220±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(黑)2016004。

1.2.2 动物分组 适应性饲养7 d后将过于迟钝或反应特别敏感的大鼠剔除，保留60只大鼠作为实验用。按随机原则，分出12只为正常组，再分出12只为假手术组，其余大鼠用于AD模型制备。取AD造模成功大鼠24只，按照随机数字表法分为模型组和头穴丛刺组，每组各12只。

1.3 AD模型制备

采用双侧海马内注射Aβ1-42诱导AD模型。采用1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，固定大鼠于脑立体定位仪上，常规备皮，切开皮肤，选取双侧海马区作(前囟后3.0 mm，中线分别向左右旁开2.5 mm，硬膜下3 mm)为注射靶区，用牙科钻将颅骨钻开，应用微量进样器将Aβ1-42溶液2.5 μg/μL缓慢注入，5 min内注射完，留针5 min。撤针后，牙科泥封住颅骨孔，将庆大霉素滴于术区，常规缝合皮肤并消毒。假手术组除用等量生理盐水代替Aβ1-42溶液外，其余同模型组。

1.4 干预方法

1.4.1 头穴丛刺组 造模成功后第7天开始，参照《实验针灸学》[18]取穴，取百会穴及百会穴左侧旁开1 mm处、百会穴右侧旁开1 mm，用0.35 mm×15 mm毫针针刺，针刺深度约2 mm，每穴平补平泻快速捻转1 min，留针30 min，1次/d，连续干预14 d。

1.4.2 正常组 不给予任何处理，正常饲养。

1.4.3 假手术组、模型组 同时段抓取、捆绑固定30 min，不进行其他处理。

1.5 检测指标

1.5.1 Morris水迷宫行为学测试 分别于造模后且干预前、针刺干预后采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠空间学习、记忆能力。各组每次检测前先进行连续4 d的训练，每只大鼠训练2 min，每天4次，每次间隔30 min。在训练过程中，每次寻找平台的上限时间限定为2 min。大鼠找到平台，并爬上平台，则让大鼠在平台上停留20 s；若在上限时间内未能找到平台或未爬上平台，则将大鼠引导至平台上，并停留20 s。连续训练4 d后的次日记录各组大鼠下水后找到平台的时间，即潜伏期；而后，去除水中平台，记录大鼠1 min内穿越平台次数。

1.5.2 大鼠海马区β-APP蛋白表达 采用免疫组化法，于治疗14 d后，每组取6只大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后断头取脑组织，在冰台上剥离双侧海马组织，将海马组织放入4%多聚甲醛固定液中固定，组织经修块后，经酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋成块，制备石蜡切片。切片常规脱蜡到水，按照免疫组化试剂盒说明书进行具体步骤操作，Motic3000显微摄影系统下，每组随机选取6张切片，每张切片随机分析3个高倍镜视野，拍照并选取视野内所有阳性颗粒，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以阳性细胞数代表蛋白相对表达量。染色结果细胞核呈蓝色，阳性为黄色或黄棕色。

1.5.3 大鼠海马区β-APP mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法，采用TRIpure试剂盒(BioTeke公司)提取总RNA，紫外分光光度计测RNA浓度，按照Super M-MLV 反转录酶试剂盒(BioTeke公司)说明书的操作步骤将提取的总RNA反转录成cDNA，使用荧光定量PCR仪(BIONEER公司)并按照SYBR Green试剂盒(Solarbio公司)的要求，以β-actin作为内参基因，检测β-APP蛋白mRNA相对表达量。引物设计由生工生物工程(上海)有限公司根据Real-time PCR引物设计原则合成。引物序列：β-APP基因：F：GCGGTGAAGACAAAGTCG；R：TCAAAGTACCAGCGGGAG；扩增长度271 bp；β-actin基因：F：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC；R：ATGGAGCCACCGATCCACA；扩增长度171 bp。根据RealTimePCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式计算出各样品的目的基因相对定量结果。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠行为学比较

治疗前与干预14 d后，与正常组比较，假手术组大鼠潜伏期和穿台次数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗前和干预14 d后，与假手术组比较，模型组大鼠潜伏期均显著延长(P<0.01)，穿台次数均显著减少(P<0.01)。干预14 d后，与模型组比较，头穴丛刺组大鼠潜伏期明显缩短(P<0.01)，穿台次数明显增加(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后定位航行试验逃避潜伏期、穿台次数比较

2.2 各组大鼠海马区β-APP蛋白表达比较

与正常组比较，假手术组大鼠海马区β-APP蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠海马区β-APP蛋白表达量显著升高(P<0.01)。与模型组比较，头穴丛刺组大鼠海马区β-APP蛋白表达量明显降低(P<0.01)。见表2、图1。

表2 各组大鼠海马区β-APP蛋白表达比较

注：a.正常组；b.假手术组；c.模型组；d.头穴丛刺组。图1 各组大鼠海马组织HE染色图(400×)

2.3 各组大鼠海马区β-APP mRNA表达比较

与正常组比较，假手术组大鼠海马区β-APP基因的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠海马区β-APP基因的mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，头穴丛刺组大鼠海马区β-APP基因的mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。见表3、图2。

表3 各组大鼠海马区β-APP mRNA表达比较

图2 β-APP基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图

3 讨论

阿尔茨海默病(AD)属于中医学“痴呆”范畴。中医学对本病的认识较早，如《景岳全书·杂病谟》曰：“痴呆证，凡平素无痰，而或以郁结，或以不遂，或以思虑，或以疑惑，或以惊恐，而渐至痴呆，言辞颠倒，举动不经……其证则千奇万怪，无所不至。”又如《医林改错·脑髓篇》所载：“高年无记性者，脑髓渐空。”中医学认为，本病的形成以内因为主，多由于年迈体虚、七情内伤、久病耗损等原因导致气血不足、肾精亏耗和脑髓失养，或气滞、痰阻、血瘀于脑，神明失用而成。本病的病位在脑。脑为髓海，元神之府，神机之用。因此，课题组将头穴丛刺用于阿尔茨海默病患者的临床治疗，并发现头穴丛刺能够延缓AD的进展，改善患者的认知功能，提高患者的生活质量。头穴丛刺针法是以中医学经络理论和现代医学神经解剖理论为基础建立起来的以在头部相应治疗区进行“丛式”的针刺治疗疾病的一种方法，被广泛应用于神经系统疾病的临床治疗。

阿尔茨海默病以起病隐袭、呈进行性发展、记忆力和认知功能衰退以及人格改变为临床主要特征，其中记忆障碍是阿尔茨海默病典型的首发征象[19-22]。海马区是人脑边缘系统的重要组成部分，主要有长时记忆的存储转换和定向等功能，是大脑参与学习记忆过程的关键结构。因此，本实验以海马区作为观察研究的对象。学习记忆的评价是阿尔茨海默病动物模型的必要检测指标之一。Morris水迷宫以其能够提供较为丰富的实验参数，能够系统的反映实验动物的学习记忆水平而被广泛应用于学习记忆脑机制等领域的基础和应用研究中[23-25]。同时，Morris水迷宫还具有操作简便、数据误差较小的特点。本实验结果表明，干预14 d后，与模型组比较，头穴丛刺组大鼠潜伏期明显缩短，穿台次数明显增加，说明头穴丛刺能够改善AD模型大鼠学习、记忆能力。

阿尔茨海默病的主要特征性病理改变表现为老年斑、神经元纤维缠结、海马锥体细胞颗粒空泡变性和神经元缺失[26-28]。其病因与发病机制至今尚未完全阐明，目前有多种学说[29-31]。有研究表明，细胞外聚集的β-淀粉样蛋白在脑内沉积形成老年斑，进一步激化小胶质细胞，导致炎症反应，诱发氧化应激损害，使细胞凋亡途径被激活，促进Tau蛋白异常磷酸化[32]。β-淀粉样蛋白是一种疏水性强且易聚集的多肽蛋白，已知其主要成分有Aβ1-40和Aβ1-42。研究发现，β-淀粉样蛋白在脑组织的沉积与异常代谢与神经元损伤、记忆障碍等密切相关，是阿尔茨海默病发病的重要环节[33-34]。因此，本实验采用海马区双侧注射Aβ制备大鼠阿尔茨海默病模型，该方法能够快速构建阿尔茨海默病急性损伤模型，动物会随之出现与阿尔茨海默病患者相似的记忆功能障碍。本实验结果表明，治疗前，与假手术组比较，模型组大鼠潜伏期显著延长，穿台次数显著减少，说明模型组出现学习能力下降，表明本实验造模成功。

β-淀粉样蛋白为β-淀粉样前体蛋白(APP)的水解产物，是老年斑的核心，其α、β、γ分泌酶参与其合成代谢。APP普遍存在于脑脊液、血液中，可在人体多数细胞中表达。生理状态下，APP发挥着保护神经细胞的作用，能够促进神经营养活性及神经生长，与学习、记忆功能相关[35]。在病理状态下，当APP过表达，则会导致具有细胞毒性作用的β-淀粉样蛋白沉积。另有研究表明，当β分泌酶将APP切割成β-淀粉样蛋白而聚合形成不溶性高分子聚合物，进而参与老年斑的形成[36]。本实验观察到，模型组大鼠海马区β-APP蛋白表达及mRNA表达水平均显著升高，表明β-APP参与AD大鼠模型的病理过程；头穴丛刺能明显下调β-APP蛋白表达及mRNA表达水平。

综上所述，运用头穴丛刺针刺法能有效改善AD大鼠学习记忆能力，其机制可能与调控海马区β-APP蛋白表达有关。