UG-FNAC联合BRAFV600E突变检测对TIRADS 4类结节的诊断价值

田姝琪，汪耘吉，谭 孟，李春华，祝玉祥，闫彩凤，冯尚勇

(1.扬州大学附属苏北人民医院 a.内分泌代谢科；b.普外科，江苏 扬州 225001；2.大连医科大学第一临床医学院，辽宁 大连 116044)

流行病学表明，高达65%的普通人群可超声检出甲状腺结节(thyroid nodule, TN)，其中恶性结节占10%，甲状腺超声是评估其良恶性的基本方法[1]。2017年美国放射学会(American College of Radiology，ACR)提出采取积分制将TN分为ACR-TIRADS(ACR Thyroid Imaging, Reporting and Data System) 1～5类，该方法较以往的TIRADS分类标准更为细致客观，得到了临床医生的广泛认可。ACR-TIRADS4类TN的恶性风险在5%～20%之间，需要进一步评估其病理性质后制定其治疗方案[2]。超声引导下细针穿刺细胞学检查(ultrasound-guided fine needle aspiration cytology, UG-FNAC)是国内外指南均推荐的鉴别TN良恶性的主要方法。目前普遍采用Bethesda分类标准进行细胞学诊断，采用液基薄层细胞学技术(thinprep cytologic test, TCT)处理穿刺标本明显减少了红细胞的干扰[3]。然而，UG-FNAC受到操作者经验、病例选择、结果判读等影响，仍有20%～30%的结节无法确定良恶性[1, 4]。研究表明，鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1V600E (BRAFV600E)基因突变对甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)具有高度的特异性，是诊断PTC的主要分子标志物，但其敏感性相对较低。目前针对UG-FNAC联合BRAFV600E基因突变对ACR-TIRADS4类结节的诊断价值的研究尚缺乏相关资料。

1 资料与方法

1.1病例选择 2018年1月至2021年6月在扬州大学附属苏北人民医院经超声检查评估为ACR-TIRADS 4类的TN，进一步行UG-FNAC和BRAFV600E突变检测并行手术治疗患者471例，男性110例，女性361例，年龄17～78岁，平均(44.2±9.8) 岁，以术后病理诊断为金标准。纳入标准：具有完整的临床资料、甲状腺功能及抗体检查、超声检查、UG-FNAC细胞学病理结果、BRAFV600E报告和术后组织学病理报告。排除标准：既往甲状腺手术史、颈部放射治疗史及资料不完整的患者。本研究经扬州大学附属苏北人民医院伦理委员会批准，所有患者分别在医生告知情况后签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1甲状腺功能及抗体测定 采集患者清晨空腹外周静脉血，应用德国罗氏全自动发光分析仪(Cobase601)进行测定，促甲状腺素(thyroid stimulating hormone, TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine, FT4)、甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody, TGAb)。参考值范围分别为：0.27～4.2 mIU/L, 3.1～6.8 pmol/L, 12～22 pmol/L, 0～115 IU/L, 0～34 IU/L。

1.2.2甲状腺超声检查 由相对固定的高年资超声科医师对患者颈部进行超声检查，并文字记录TN的影像学特征后存储TN病灶的具体图像。使用2017版ACR-TIRADS报告评分系统，对TN进行分类，如果无法分类或超声评估医生存在分歧，由2位副高级职称医生会诊后评分为最终分类。根据纵横比大于1、实性结节、低回声、点状强回声、边缘不规则五个可疑特征的数目，将超声评估为TIRADS4类的结节分为4a类(1个)、4b类(2个)和4c(3～4个)3个亚类[5]。

1.2.3UG-FNAC检查 经知情同意后，由固定的医生在超声引导下对ACR-TIRADS4类TN进行穿刺，将穿刺的针头在盛有10 ml BD CytoRich Red 固定液的离心管内涮洗，将针管内的标本全部转移到离心管内并做好标记送检病理科。本研究UG-FNAC细胞学穿刺结果参照2017版甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统推荐的分类标准，将结果分为6类，将Ⅰ～Ⅳ类定义为良性组，Ⅴ类和Ⅵ类定义为恶性组。

1.2.4BRAFV600E基因检测 将穿刺所得的样本进行DNA提取(厦门艾德生物医药公司核酸提取试剂)，应用紫外分光光度计测定DNA浓度，其OD260/OD280在1.8～2.0之间，应用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)法检测BRAFV600E突变(扩增方法：ADx-ARMS方法；仪器：美国应用生物系统公司StepOnePlus Thermal Cycler；扩增试剂：厦门艾德生物公司的人类BRAFV600E突变检测试剂盒)。若突变检测管的FAM信号扩增呈S型曲线且Ct值<30，则为突变型；若样品的FAM信号扩增曲线不呈S型曲线或Ct值≥30，则为野生型。诊断标准：突变型诊断归为恶性组，野生型诊断归为良性组。

2 结 果

2.1临床资料及术后病理类型 本研究共纳入TN患者471例，以术后组织病理结果为金标准分为良性组和恶性组。恶性组298例，均为PTC；良性结节173例，其中结节性甲状腺肿106例，甲状腺腺瘤47例，桥本甲状腺炎7例，肉芽肿性炎10例，局部纤维增生3例。临床资料分析表明：两组性别、结节直径、FT3、FT4、TPOAb、TGAb差异无统计学意义, 但年龄和TSH差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。超声特点分析表明：两组之间的结节回声性质、钙化类型分布、纵横比>1、形态及血供分布特点均存在显著差异(P<0.05)。见表2。两组的 UG-FNAC和BRAFV600E突变检测的结果分布均存在显著差异(P<0.05)。见表3，BRAFV600E突变检测阳性与阴性情况，见图1，2。

表1 两组临床资料比较

表2 两组结节超声特征比较[例(%)]

表3 两组UG-FNAC和BRAFV600E突变检测诊断分布比较[个(%)]

图1 BRAFV600E突变阳性

图2 BRAFV600E突变阴性

2.2不同检查方法对TIRADS4类结节的诊断效能 UG-FNAC联合BRAFV600E突变检测诊断ACR-TIRADS4类结节的Se和NPV分别为95.6%和92.9%，优于UG-FNAC(75.8%、70.4%)和BRAFV600E突变检测(56.7%、57.0%)。计算AUC评估诊断效能，UG-FNAC联合BRAFV600E突变检测(0.970)对ACR-TIRADS 4类结节的诊断效能优于单独UG-FNAC(0.873)或BRAFV600E突变(0.778)，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。UG-FNAC联合BRAFV600E突变检测诊断TIRADS4a、4b、4c类结节的PPV、NPV、Se、Sp详见表5，AUC分别为0.961(95%CI：0.925～0.996)、0.972(95%CI：0.946～0.972)、0.981(95%CI：0.956～1.000)。

表4 不同诊断方法对ACR-TIRADS4类结节的诊断价值

表5 UG-FNAC联合BRAFV600E突变检测对ACR-TIRADS4类不同亚分类结节的诊断价值

3 讨 论

本研究471例TI-RADS4类结节中恶性结节占63.27%(298/471)，远高于美国指南中的恶性风险，与我国指南推荐相似，其原因可能与研究人群选择相关。恶性结节组的超声检查多呈低回声、钙化、纵横比>1、形态不规则，但血供分布缺乏特征性改变，与之前指南推荐及回顾性研究相符，钙化类型以点状钙化最多见(154/298)，血供分布以混合血管型最多、中央血供为主型次之、边缘血管型最少。

TN是临床常见病，检出率随超声检查的普及而增加，大部分为良性结节，恶性甲状腺结节以PTC多见，TIRADS4类结节恶性风险颇具争议[6]。471例ACR-TIRADS4类结节中，女性与男性之比为3.28∶1(361/110)，良性组与恶性组性别比例分别为3.12∶1和3.38∶1；恶性组结节的患病年龄低于良性组，平均年龄(42.2±10.8)岁，与Miao等[7]研究结果相似。在健康人群中筛查甲状腺超声造成的过度诊断增加了甲状腺癌的发病率，其中以PTC增加更显著，年轻人群可能更重视自身健康而提前了甲状腺癌的发现时间，可能还与目前环境内分泌干扰物、工作节奏加快等因素相关[7-8]。本研究发现恶性组TSH水平高于良性组(P<0.05)。血清TSH水平升高可能通过诱导与甲状腺癌不良预后相关的通路发生转化而增加分化性甲状腺癌的侵袭性[9]。

超声检查是评估TN恶性风险的最佳影像学检查手段，具有无创、简便、便于长期随访等优势，但易受到操作者经验的影响，2017年美国放射学会参照乳腺影像报告与数据系统的制定方法发表《ACR甲状腺影像报告与数据系统白皮书》，采取积分制将结节分为ACR-TIRADS 1～5类，研究发现，从TIRADS 1～5类，恶性肿瘤的风险呈显著上升趋势，TIRADS4类结节的风险阈值评估为5%～20%之间，中华医学会制定的2020中国TN超声恶性危险分层指南即C-TIRADS中指出TI-RADS4类结节的恶性风险在2%～90%之间[2, 6]。因TI-RADS4类结节恶性风险不确定性高，对诊断干扰较大，有必要进一步完善检查。

UG-FNAC是评估TN有效、经济检查方法，影响着TN的治疗决策，直径大于10 mm或侵犯颈部临近血管、神经等解剖结构的TIRADS4类结节更建议综合考虑风险与获益后积极获取细胞学病理[6]。相较于常规细胞学涂片检查，TCT技术更好地保存细胞学标本，在UG-FNAC中广泛应用。本研究中UG-FNAC诊断4类结节的PPV和Sp在98%以上，但Se、NPV不足80%，与廖丽燕等[10]研究结果相似，郑斌等[11]研究则发现PPV、NPV、Sp和Se均可在90%以上，考虑与使用的超声诊断分层方法差异有关，本研究与廖丽燕等[10]研究均采用ACR制定的TIRADS标准，郑斌等[11]则是采用基于ACR的改良版TIRADS标准。由于受到穿刺结节的大小、质地、钙化、钙化形式以及操作者经验和细胞病理学家的影响，有20%～30%不能通过细针穿刺活检明确为良性或恶性[12]。本研究中Bethesda Ⅰ类和Ⅲ类结节占总穿刺标本的22.08%(104/471)，良性组和恶性组中Bethesda Ⅰ类和Ⅲ类结节在本组穿刺标本中占比分别为23.12%(40/173)和21.48%(64/298)。

血清学标记物(如血清胸苷激酶1、甲状腺球蛋白、甲状腺转移因子1)、分子标记物(如BRAFV600E突变、RAS突变、RET/PTC重排)与甲状腺恶性结节相关[13]。BRAF是MAPK信号通路的关键促进因子，在细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，BRAFV600E突变是分化型甲状腺癌尤其是PTC所特有的分子标记物，与PTC出现多灶性、淋巴结和甲状腺外转移及复发等不良预后相关。既往研究显示，PTC中BRAFV600E突变的敏感性较低且与地区种族相关，高碘摄入的韩国超过80%，西方国家不足10%，中国人群突变率可达80%[14, 15]。本研究恶性组中BRAFV600E基因检测为野生型者占43.29%(129/298)，约半数的恶性结节仍可能被漏诊。本研究中BRAFV600E突变检测诊断TN的PPV和Sp在95%以上，但NPV和Se不足60%，容易造成较高的漏诊率。

由此可见，单独应用UG-FNAC和BRAFV600E均会造成较高的漏诊率。多项针对UG-FNAC细胞学不确定结节的研究表明，BRAFV600E突变检测联合UG-FNAC，可显著提高诊断敏感性，并保持良好的特异性，尽管在FNA标本中存在假阴性或假阳性的BRAFV600E突变，并不影响对TN总体的辅助诊断效能，联合应用仍可提高对恶性肿瘤的预测效能[16]。；韩英等[17]发现Bethesda系统联合BRAFV600E检测可使TN诊断的Se由不足70%提高到87.8%，NPV由60%左右提高到79.7%，Sp、PPV保持90%以上。本研究中UG-FNAC联合BRAFV600E基因突变检测的Se、NPV由不足80%分别提高到95.6%和92.9%，并保持非常好的Sp、PPV，充分保留了敏感度、阴性预测值与特异度、阳性预测值的互补作用。超声评估的TIRADS4类结节的恶性风险范围随分级的增高而增加，4c类结节恶性风险范围最大(21%～91.9%)[5]。谭兴利等[18]研究UG-FNAC诊断4a、4b、4c类结节的Sp在90%左右，但Se仅80%左右。本研究UG-FNAC联合BRAFV600E突变检测诊断TIRADS4a、4b、4c的敏感度和特异度均在90%以上，计算AUC分别为0.961、0.972和0.981，对存在1项及以上可疑超声特征的4类结节同时行细胞病理学检查和BRAFV600E突变基因检测可提高诊断效能。

综上所述，TIRADS4类结节的恶性风险跨度大，采用TCT处理UG-FNAC标本联合BRAFV600E突变检测对ACR-TIRADS4类的不同亚类结节均具有较高诊断准确率，能够有效地指导临床医生做出合理的治疗方案，减少漏诊和误诊。