基于网络药理学研究阳和汤促进肛瘘术后创面组织修复的作用机制

朱粟意，张相安，黄芳芳，郜志诚，席岚岚

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

肛瘘是一种常见肛肠疾病，主要表现为流脓、瘙痒、疼痛等局部症状，易反复且不易治愈，严重影响患者身心健康[1-2]。临床多采用手术治疗，但肛瘘术后创口易污染，严重影响患者预后，因此促进肛瘘术后创面组织修复已然成为治疗肛瘘术后研究热点[3-4]。阳和汤是清代王洪绪《外科证治全生集》中名方，由熟地黄、麻黄、鹿角胶、白芥子、肉桂、生甘草、炮姜组成，初衷用于治疗“气血寒而毒凝”之阴疽等外科疾病，现代药理研究认为其具有抗菌、镇痛、消炎、抗癌等作用[5-7]。因此本研究基于网络药理学对阳和汤促进肛瘘术后创面组织修复的作用靶点、通路等方面进行探究，以期揭示其分子作用机制。

1 资料与方法

1.1阳和汤活性分子筛选 通过TCM-ID(http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/)网站及中药综合数据库[8](Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/)，筛选出阳和汤方剂中熟地黄、麻黄、鹿角胶、白芥子、肉桂、生甘草、炮姜药物的主要化学成分。通过BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)平台[9]预测药物化学成分作用靶点蛋白并去重。

1.2肛瘘术后创面组织修复相关靶蛋白预测 分别以“Tissue repair”、“wound healing”作为关键词在DigSee(https://omictools.com/digsee-tool)和polysearch 2.0(http://polysearch.ca/)网站查找下载与创面组织修复相关的靶标，之后应用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库[10]对疾病靶点基因名进行基因名转换，并筛选去除重复基因。

1.3靶点网络构建 为明确药物阳和汤与肛瘘术后创面组织修复相互作用，将1.1中筛选得到的药物靶点与1.2中筛选得到的疾病靶点输入生物信息学和进化基因组学网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，取其交集，获得药物-疾病共同靶蛋白。之后将药物阳和汤-疾病肛瘘术后创面组织修复共同靶蛋白应用STRING10.5平台[11](https://string-db.org/)构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为中等“highest confidence”(>0.9)，其他参数保持默认设置。使用Cytoscapy 3.6.1(http：//www.cytoscape.org)软件对 PPI 网络进行分析和可视化处理。

1.4GO注释和KEGG富集分析 利用在线富集分析工具Enrichr网站(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)对共同靶蛋白进行GO和KEGG富集分析，GO数据库对筛选出的共同靶蛋白进行功能注释，KEGG数据分析共同靶蛋白参与的信号通路，筛选标准为P<0.05。

2 结 果

2.1阳和汤活性分子信息分析及靶点预测 在BATMAN-TCM平台依次输入阳和汤方剂中熟地黄、麻黄、鹿角胶、白芥子、肉桂、生甘草、炮姜，去重后共筛选到化学成分共263个(见表1)，然后利用“药物靶点-相似性”模型，取相似性评分大于20的作用靶点做后续分析，共得到1 730个潜在靶点蛋白。

表1 阳和汤中主要活性分子信息

2.2肛瘘术后创面组织修复相关靶点预测 DigSee网站筛选到肛瘘术后创面组织修复相关靶点共256个，polysearch网站筛选到肛瘘术后创面组织修复相关靶点共298个。应用Uniprot数据库对靶点基因名进行基因名转换，筛选去除重复项后共获得455 个肛瘘术后创面组织修复相关靶点。进一步将数据导入生物信息学和进化基因组学网站绘制韦恩图，结果发现阳和汤药物-肛瘘术后创面组织修复共同靶点共有134个(见图1)。

图1 阳和汤-肛瘘术后创面组织修复共同靶点韦恩图

2.3GO分析 采用Enrichr网站分析134个共同靶点的GO生物功能注释分析，主要包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)及细胞成分(cell component，CC)等，BP包括促进基因表达、细胞间信号传递、细胞增殖等生物学过程；MF包括细胞因子活性、细胞因子受体结合等功能；CC主要包括内腔分泌颗粒、血小板α颗粒、RNA聚合酶Ⅱ转录复合物等。见图2。

2.4KEGG富集分析 采用Enrichr进行KEGG分析结果发现，阳和汤治疗肛瘘术后创面组织修复134个差异靶点的效应机制，选取校正后P值<0.05，且于创面组织修复相关的信通路，主要涉及多种癌症信号通路、磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase-protein kinase，PI3K-Akt)信号通路、辅助性T淋巴细胞17(Th17)分化信号通路、缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)信号通路等。见表2。

表2 阳和汤促进肛瘘术后创面组织修复关键靶标KEGG分析

2.5靶点网络分析 根据STRING平台阳和汤治疗肛瘘术后创面组织修复关键靶标蛋白，导入Cytoscapy 3.6.1软件，根据degree大小进行对PPI网络可视化分析(见图3)，共涉及131个节点，1 535条边，图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联。图中节点的大小表示degree的大小，节点越大，对应的degree越大。边的粗细表示combine score，边线越粗combine score值越大。当degree>50时，白细胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)肿瘤蛋白53(tumor protein 53，TP53)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor1，IGF1)等为PPI网络中关键节点，进一步取MCODE得分>0.4分的关键基因进行相互作用分析，得到3个子网(见图4)。

注：红色圆圈代表节点，灰色线条代表边。A，25个节点，256个边；B，27个节点，124个边；C，14个节点，50个边。

3 讨 论

中医认为，肛痈溃后余毒未尽，结滞不散或因脏腑素虚，气血壅结，复感邪毒，肉腐成脓为肛瘘的病因病机。中医治疗肛瘘多以清热燥湿、补气化瘀为主要原则[12]。据《外壳全生集》中记载，阳和汤具有温阳散寒、活血化瘀、通络散结的功效，方剂中熟地黄具有益血生精、生发元气、提高患者免疫力之功效；鹿角胶可温补肾经、促进垂体性腺分泌，具有补肝养肾、益精生髓之功效；白芥子具有通阳散滞、消痰散结之功效；炮姜具有协调脾胃、破阴和阳、化赤生血、托毒排脓之功效；麻黄具有开腠达表之功效；甘草具有解毒及调和诸药之功效[13]。中药具有多成分、多靶点的特点，较化学药单一成分作用机制更为复杂，网络药理学是基于系统生物学发展而来的药理分析新方法，非常适合中药复方的作用机制研究[14-15]。

本研究借助BATMAN-TCM平台共筛选阳和汤方剂中共263主要化学成分，其中熟地黄化学成分包括地黄素D、地黄苷A、尿苷等共8个，麻黄化学成分包括α-亚麻酸、邻苯二甲酸二甲酯、二乙二醇单丁醚等共127个，鹿角胶化学成分为磷酸钙和碳酸钙共2个，白芥子化学成分主要有4-异硫氰酸、丁基异硫氰酸酯、3-丁烯基-异硫氰酸酯等共23个，肉桂化学成分主要有肉桂醛、原花青素B、香豆素等共18个，生甘草化学成分主要有正十四碳烷、十三碳烯、1,22-二十二醇等共74个，炮姜化学成分主要有姜醇、β-红没药烯、姜油酮等共11个。共筛选到靶点蛋白1 730个，与455个肛瘘术后创面组织修复相关靶点取交集，得到134个阳和汤药物-肛瘘术后创面组织修复相关靶点交集基因，其生物学功能涉及基因表达、细胞间信号传递、细胞增殖、炎症、免疫调节等。谢昌营等[12]研究报道，肛瘘创面修复主要包括炎症反应阶段、细胞增殖阶段及组织重塑阶段，而减轻炎症反应，促进肛周组织细胞增殖是提高肛瘘术后修复的关键因素。张利新等[16]研究报道，解除创面血管痉挛，改善局部微循环及组织影响，提高新陈代谢水平，促进肉芽组织细胞增生可显著缩短肛瘘术后创面愈合时间，减轻患者痛苦。本研究结果还发现，交集基因富集于PI3K-Akt信号通路、Th17分化信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路可参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能调节。Th17细胞是一种能够分泌IL-17的T细胞亚群，在自身免疫性疾病和集体防御过程中具有重要意义；HIF-1是一种具有转录活性的核蛋白，与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等多中靶基因密切相关。综合本研究结果提示，阳和汤可能通过细胞增殖、炎症反应及免疫调节等信号通路参与对肛瘘术后创面组织修复具有促进作用。本研究进一步对靶点蛋白进行PPI网络分析发现，IL-6、EGFR、TNF、IGF1等为PPI网络中关键节点。IL-6是有活化T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，可促进B细胞产生抗体，协同集落刺激因子促进骨髓源细胞生长和分化，增强自然杀伤(natural killer，NK)细胞的裂解功能，在造血、免疫调节及炎症反应中起重要作用。TNF由活化巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生，具有抑制或促进细胞增殖、调节机体免疫功能等多种作用。姚志涛等[17]研究报道，髁状突囊内发生骨折后，IGF1首先被激活，进而使得其下游的PI3K/Akt信号通路激活,导致炎症相关因子IL-1和IL-6表达增强。苗大兴等[18]研究报道，肛瘘术后感染患者血清IL-6、TNF-α等指标显著高于非感染者。EGFR是上皮生长因子细胞增殖和信号转导的受体，在细胞生长、增殖和分化等生理过程发挥重要作用。肖祝华等[19]研究报道，与正常组比较，大肠埃希菌腹泻小鼠模型组TGF-β1、EGFR表达量均明显升高，辣蓼可不同程度调节肠组织中TNF-α、TGF-β1、EGFR表达，改善肠道黏膜屏障，促进受损肠黏膜修复。综合以上文献报道及本研究结果提示，阳和汤可能通过IL-6、EGFR、TNF、IGF1等关键节点基因介导炎症反应、免疫应答及细胞增殖分化等相关PI3K-Akt信号通路、Th17分化信号通路、HIF-1信号通路等，促进肛瘘术后创面组之修复。

综上所述，阳和汤促进肛瘘术后创面组织修复是多靶点、多通路的复杂过程，可能与细胞炎症反应、免疫应答及细胞增殖分化等相关代谢通路密切相关，网络药理学分析为深入探究阳和汤促进肛瘘术后创面组织修复的机制提供重要参考。由于网络药理学研究基于网络建模、数据库资源开发及软件应用等，不同数据库的质量、更新速度、收录范围等均有一定差异，可能会导致分析结果有一定偏差，另因网络模型与机体内环境也存在一定差异，因此还应结合实验对网络预测结果进一步验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。