针刺对阿尔茨海默症小鼠海马CA1 区树突结构及认知功能影响的研究

曹 育,安玉兰,张卓铭,翟春涛,武峻艳

(1.山西中医药大学第三临床学院推拿科,山西晋中 030619;2.山西中医药大学基础医学院中医医学史教研室,山西晋中 030619;3.山西中医药大学第三临床学院针灸科,山西晋中 030619;4.山西中医药大学第三临床学院脑病一科,山西晋中 030619)

阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD)是以记忆力障碍、执行功能损害和人格改变等全面性痴呆表现为特征的神经退行性疾病。 AD 占痴呆诊断的80%,自2010 年以来,AD 的发病率呈逐年上升趋势[1]。 许多研究表明,线粒体功能障碍、Tau 蛋白异常磷酸化、氧化应激损伤等均与AD 的发生密切相关[2]。 遗憾的是,目前还没有药物能够有效治疗AD。 针灸作为祖国传统医学,为AD 的预防和治疗提供了思路[3-4]。 中医认为,AD 的发生以本虚为主,患者肾虚精亏,不能上充于脑,最终脑髓空虚导致灵机使用,引发痴呆。 依据“肾脑相济”理论,针刺百会、肾俞和太溪穴可以改善痴呆大鼠的认知功能[5]。 然而针刺治疗AD 的生物学机制目前尚未明确。

有研究显示,痴呆患者的海马神经轴突营养不良,并且存在树突棘丢失和树突复杂性降低等现象[6]。 可溶性Aβ 蛋白可破坏突触超微结构和马神经元树突结构、减少棘突密度,引起痴呆认知功能障碍[7]。 海马CA1 区椎体细胞损伤与神经认知功能障碍密切相关[8]。 为了探讨针刺治疗AD 的机制,本研究以SAMP8 快速老化小鼠为研究对象,观察针刺百会、肾俞和太溪穴后小鼠海马CA1 区树突结构及认知功能的变化。

1 材料和方法

1.1 实验动物

24 只SPF 级快速老化雄性SAMP8 小鼠和12只SPF 级雄性正常老化SAMR1 小鼠,均7 月龄,体重(32.23±5.09)g,购于至善(北京)健康医学研究院[SCXK(京)2017-0001]。 在温度 20℃ ~25℃、湿度为40%~60%的环境中,明暗周期为12 h/12 h 条件下于山西中医药大学实验动物中心[SYXK(晋)2018-0002]饲养,允许所有小鼠自由进食和进水,适应性喂养一周后进行后续实验。 本研究所有操作严格遵循中国实验动物福利法,符合3R 原则。动物实验经过山西中医药大学动物实验伦理委员会批准(SZLLSC2019-0160)。

1.2 主要试剂与仪器

Golgi 染色试剂盒(批号HTKNS1125)购于北京博蕾德科技发展有限公司; 戊巴比妥(批号2017089)和多聚甲醛(批号2017087)购于北京迈瑞达科技有限公司;免疫组化检测试剂盒(批号074K00)、BCA 蛋白检测试剂盒(批号 L2800)、SDSPAGE 凝胶制备试剂盒(批号67H04)均购于美国Sigma 公司;Tau(批号 ab109302)、Aβ1-40(批号ab00109)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)(批号ab223354)、突触素(Synaptophysin,SYN)(批号321207)、微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein 2,MAP2) (批号ab870921)和GAPDH 内参抗体(批号ab204276)均购于英国Abcam 公司;水迷宫设备购于上海软隆科技发展有限公司;针灸针购于泰兴市天和医疗器械有限公司;KH-LQ3800 冰冻切片机购于湖北孝感阔海医疗科技有限公司;CX31 光学显微镜为日本奥林巴斯公司生产;WD-9413B 型凝胶成像分析系统购于济南东仪实验室设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及治疗

将24 只SAMP8 小鼠随机分为模型组和针刺组,每组12 只;将12 只 SAMR1 小鼠作为对照组。针刺组采用针刺治疗8 周,模型组和对照组正常饲养,不进行干预。 参考《普通高等教育“十一五”国家级规划教材:针灸学(第2 版)》,选取百会穴(顶骨正中)、肾俞穴(第2 腰椎下两旁约5 mm)、太溪穴(内踝后方凹陷部位),用30 号针刺入,每次留针20 min,每隔5 min 行针一次,行针时捻针速度为每分钟200 次,捻针20 次为行针1 次。 隔日针刺一次,连续针刺治疗8 周。

1.3.2 Morris 水迷宫实验检测小鼠认知功能

针刺治疗8 周后,用Morris 水迷宫实验检测所有小鼠的学习记忆能力[9]。 该实验分为两个部分:(1)定位导航实验:将小鼠放入水中(水深约20~25 cm,水温约(23±1)℃)自由游泳2 min,适应环境。 每天训练4 次,共训练5 d。 选取水迷宫其中1 个象限放置平台,将经过环境适应的小鼠小心放入水池。 记录4 次小鼠2 min 内寻找到平台的时间(逃避潜伏期),计算平均值。 (2)空间探索实验:上述实验完成后将平台撤除,并将小鼠从某一象限小心放入水中,记录小鼠2 min 内的跨平台次数。

1.3.3 Golgi 染色观察海马CA1 区锥体细胞树突结构

每组随机选取8 只小鼠,用2%戊巴比妥麻醉,剂量为10 mL/kg。 固定小鼠,开胸后暴露心脏,剪开左心室,插入灌注针至升主动脉,血管夹固定主动脉处。 灌注无菌生理盐水,待右心耳肿大后剪破,观察到肝肺变白,右心耳流出液澄清后,灌注4%多聚甲醛。 待全身僵硬后取脑。 每组中随机选4 只进行 Golgi 染色。 Golgi 染色:取完整脑组织于Golgi-Cox 中,避光放置2 周。 经过海马区冠状面以厚度为100 μm 作连续切片。 无菌蒸馏水漂洗,浸泡于Golgi-Cox 溶液,去离子水漂洗。 梯度乙醇脱水,二甲苯透化,中性树胶封片。 光学显微镜下观察小鼠海马CA1 区的Golgi 染色,椎体细胞选择的标准为:椎体细胞位于CA1 区内;细胞的形清晰,胞体及分支的染色均一致;第三分支完整。 应用Image J 软件(Neuron J 分析插件)量化树突数量和长度,用Sholl 进行树突复杂性分析。 以神经元胞体为中心,做间距为40 μm 的同心圆,分析树突和同心圆的交点数,以反映树突分支数量。

1.3.4 免疫组织化学染色法检测海马 CA1 区Aβ1-40和 Tau 蛋白表达

每组随机选4 只小鼠用于免疫组织化学染色。取脑后放置于4%多聚甲醛中固定,再放入30%蔗糖中沉淀脱水。 应用冰冻包埋剂将脑组织包埋,行冠状面连续切片,厚度为15 μm。 每只小鼠取4 张切片进行免疫组织化学染色。 步骤如下:首选灭火内源性过氧化物酶,随后0.01% PBS 冲洗3 次,再进行微波抗原修复。 用10%山羊血清孵育1 h,随后吸除羊血清,加入 Aβ1-40抗体或 Tau 抗体,4℃湿盒内孵育过夜,滴加生物素标记的二抗,再次孵育30 min,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白工作液,最后用二氨基联苯胺(DAB)显色15 min,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 显微镜下观察,选取海马CA1 区10 个高倍镜视野,对阳性表达区(染色为棕黄色)进行图像分析,测定光密度值。

1.3.5 Western blot 检测海马 CA1 区 BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表达水平

选取4 只小鼠,取海马 CA1 区检测蛋白。 用RAPI 裂解液提取组织总蛋白,用BCA 试剂盒检测BDNF、SYN 和 MAP2 蛋白浓度,电泳,分离蛋白,转至PVDF 膜。 5%脱脂奶粉封闭2 h,加入抗BDNF(1∶500)、抗 SYN(1 ∶200)或抗 MAP2(1 ∶500),4℃ 过夜孵育。 用TBST 缓冲液洗涤3 次后加入二抗(羊抗兔,1 ∶500),封闭 1 h。 以 GAPDH 作为内参,用ECL 发光仪对蛋白成像,灰度值用 Image J 软件分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 三组小鼠认知功能比较

三组小鼠的逃避潜伏期和跨平台次数的差异有统计学意义(F值分别为26.002 和18.734,P<0.001)。 与对照组比较,模型组水迷宫训练第5 天时逃避潜伏期较高,而跨平台次数较低(P<0.001)。与模型组比较,针刺组水迷宫训练第5 天时逃避潜伏期较低,而跨平台次数较高(P值分别为0.009 和0.001),见图 1。

图1 Morris 水迷宫实验检测小鼠学习记忆功能(n=12)Note. A, Escape latency of mice in each group was compared on the fifth day of water maze training. B,Comparison of cross platform times of mice in each group. Compared with the control group, *P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05. The same as below.Figure 1 Morris water maze test to detect learning and memory function in mice

2.2 三组海马CA1 区树突结构比较

Golgi 染色显示,对照组小鼠海马CA1 区椎体细胞形态良好,模型组小鼠椎体细胞受损,而8 周的针刺治疗可以改善SAMP8 小鼠椎体细胞损伤(图2A)。 三组小鼠的基底树突长度、顶端树突长度、基底树突分数数目和顶端树突分支数目的比较均有统计学意义(F值分别为18.001、21.561 和9.089,P<0.01)。 与对照组比较,模型组基底树突长度、顶端树突长度、基底树突分数数目和顶端树突分支数目均较低 (P值分别为 0.013、0.009、0.037 和0.010)。 与模型组比较,针刺组上述指标均较高(P值分别为 0.022、0.016、0.013、0.032),见图 2B。Sholl 分析中,同心圆半径为40 μm、80 μm、120 μm、160 μm 时,模型组交点数明显低于对照组,而针刺组明显高于模型组(P<0.05),见图2C。

图2 三组海马CA1 区树突结构比较(n=4)Note. A,Golgi staining to observe the morphology of vertebral neurons in hippocampal CA1 area, ①,Control group. ②,Model group. ③,Acupuncture group. B, Image J software (Neuron J analysis plug-in) analyzes the number and length of dendrites. C, Sholl analysis of dendritic branches.Figure 2 Comparison of the dendritic structure of the hippocampal CA1 area of the three groups

2.3 三组海马CA1 区Aβ1-40表达水平比较

Aβ1-40和Tau 阳性细胞均为胞浆内呈现棕黄色沉淀物。 三组小鼠海马CA1 区Aβ1-40和Tau 表达的平均光密度值的比较有统计学意义(F值分别为10.890 和 7.562,P均<0.01)。 与对照组比较,模型组Aβ1-40和Tau 表达的平均光密度值较高(P均<0.001)。 与模型组比较,针刺组上述指标较低(P均<0.05),见图3。

图3 免疫组织化学染色法检测海马CA1 区Aβ1-40和Tau 表达(n=4)Figure 3 Immunohistochemical staining method to detect the expression of Aβ1-40 and Tau in hippocampal CA1 area

2.4 Western blot 检测海马 CA1 区 BDNF、SYN和MAP2 蛋白表达水平

三组海马 CA1 区 BDNF、SYN 和 MAP2 蛋白表达水平的比较均有统计学差异(F值分别为8.098、5.443 和 10.023,P均<0.05)。 与对照组比较,模型组 BDNF、SYN 和 MAP2 蛋白表达水平均较低(P值分别为 0.001、0.008 和 0.003)。 与模型组比较,针刺组BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表达水平均较高(P值分别为 0.011、0.019 和0.007),见图 4。

图4 Western blot 检测海马CA1 区BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表达水平(n=4)Figure 4 Western blot detection of BDNF, SYN and MAP2 protein expression levels in hippocampal CA1 area

3 讨论

AD 严重影响了老年人的生存质量,给家庭和社会带来了沉重负担。 从中医角度讲,AD 的发生与肾虚有关,肾气推动运化无力,在脑内形成痰淤。AD 病变部位在大脑,但是病机为本虚标实,肾虚精亏[5]。 《医学心悟》中也提到:“肾主智,肾虚则智不足”[10]。 本研究基于“肾脑相济”理论,针刺快速老化SAMP8 小鼠的百会、肾俞和太溪穴进行治疗。 百会穴属于腧穴,是调节大脑功能的重要穴位[11];肾俞穴属足太阳膀胱经穴,对腰膝酸软、肾虚精亏的治疗有较好的疗效[12];太溪穴主治肾病,具有滋阴益肾和清热生气之效[13]。 本研究中,治疗8 周后SAMP8 小鼠认知功能和海马CA1 区的Aβ1-40和Tau蛋白表达水平均明显改善,提示针刺治疗AD 有效。研究结果与王旭等[5]报道类似。

针刺治疗痴呆的机制目前未完全明确,可能与改善脑内多巴胺水平、增加抗氧化能力、降低免疫炎症损伤、抑制神经元凋亡和促进脑血管新生等有关[14-15]。 本研究从突触可塑性角度对针刺治疗AD的机制进行探讨。 树突的形态对神经元的的生理功能起到了决定性的作用,可通过调节神经元的信号输入及对信息的处理速度和能力,进而影响突触后的输出。 既往研究证实,树突在学习记忆的形成中发挥重要作用[16]。 海马CA1 区椎体细胞损伤与神经认知功能障碍密切相关[8]。 本研究用Golgi 染色观察了海马CA1 区椎体细胞树突结构的变化,结果显示SAMP8 小鼠椎体细胞基底树突长度、顶端树突长度、基底树突分数数目和顶端树突分支数目发生异常变化,这与 Wang 等[17]报道一致。 另外,Sholl 分析结果也显示,SAMP8 小鼠的树突分支明显变少。 本研究中,SAMP8 小鼠接受针刺8 周治疗后,椎体细胞基底树突长度、顶端树突长度、基底树突分数数目和顶端树突分支数目明显增高。 提示针刺能够改善海马CA1 区树突结构实现的。

为了验证针刺对神经可塑性的影响,我们检测了海马CA1 区BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表达水平。BDNF 是学习和记忆所必须的物质,能够增强突触后致密物上N-甲基-D 天冬氨酸受体1 和2B 的磷酸化,促进长时程抑制的产生;另外,BDNF 可以调控树突和轴突的生长,影响突触可塑性[18]。 SYN 参与突触囊泡形成和胞吐,通过调节神经递质的释放,影响突触形成和发育[19]。 MAP2 是重要的细胞骨架,存在于神经元胞体和树突中,是许多蛋白激酶的底物,如细胞外调节蛋白激酶和cAMP 依赖蛋白激酶等。 MAP2 与突触可塑性及认知功能密切相关[20]。 既往有研究发现,BDNF/SYN/MAP2 信号通路与神经可塑性及认知功能密切相关[21]。 本研究显示,针刺8 周后 SAMP8 小鼠海马 CA1 区 BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表达水平明显下降。 提示针刺可能是通过BDNF/SYN/MAP2 信号通路影响海马树突结构。

综上所述,本研究发现,基于“肾脑相济”理论,针刺百会、肾俞和太溪穴可能通过激活BDNF/SYN/MAP2 信号通路,改善海马CA1 区树突长度和分支数目,从而下改善快速老化SAMP8 小鼠的认知功能。 本研究为针刺治疗AD 提供了一定的理论基础,未来需要更深入地进行机制学研究。