芦荟大黄素调控miR-30b 促进子宫内膜癌细胞自噬的研究

薛 飞,董传莹,田 莉,张春瑞

(郑州澍青医学高等专科学校临床医学系,郑州 450000)

子宫内膜癌是来源于子宫内膜上皮细胞的恶性肿瘤,近年来,其发病率和死亡率持续上升,约占女性生殖道恶性肿瘤的20%~30%,早期患者多为局限性病变,以手术治疗为主,但因早期常忽略不规则阴道排液和流血现象,易失去早期诊断的机会,而晚期及复发性患者的治疗以放化疗为主的综合性治疗[1]。 芦荟大黄素(aloe emodin,AE)是一种天然的蒽醌衍生物,可从芦荟中提取,具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、神经保护和肝保护等作用[2]。 研究发现,AE 不但能够诱导非小细胞肺癌的自噬和凋亡[3],还能通过激活人胰腺癌细胞凋亡和自噬相关通路,破坏癌细胞线粒体膜电位,具有明显的抑癌作用[4]。 另有研究发现AE 通过上调miR-133 表达减轻心肌梗死和心肌细胞凋亡[5]。 而miRNAs 是在真核生物中发现的长度约为19~25 个核苷酸的非编码小RNA,在转录后基因的表达调控中起重要作用[6],其中,miR-30b 过表达可降低自噬相关标记基因的表达且直接靶向Beclin1 基因[7]。 而Beclin1 是第一个在哺乳动物中发现的与自噬相关的抑癌基因,是调控细胞自噬活性的关键靶点[8]。 但是,目前AE 调控miR-30b 对子宫内膜癌细胞自噬的研究尚未见报道。 因此,本研究通过上调或抑制子宫内膜癌细胞 HEC-1-B 中 miR-30b 表达,并使用 AE 培养该细胞,观察其对细胞生长及自噬的影响,旨在揭示AE 调控miR-30b 促进HEC-1-B 癌细胞自噬的作用机制,为子宫内膜癌的治疗提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 细胞

人子宫内膜腺癌细胞株 HEC-1-A(目录号:TCHu149)、HEC-1-B(目录号:TCHu115)、RL95-2(目录号:TCHu198)均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;人正常子宫内膜上皮细胞株由南方医科大学实验室赠与。

1.2 主要试剂与仪器

AE(纯度:HPLC≥98%,规格:每瓶 20 mg,货号:SA8200)、BCA 蛋白定量试剂盒(货号:PC0020)和ECL 显色试剂盒(货号:SW2040)均购自北京索莱宝生物科技有限公司; 胰蛋白酶(货号:27250018)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;货号:16140071)和RPIM-1640 培养基(货号:72400120)均购自美国Giboc 公司;细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8;货号:CK04)购自上海复申生物科技有限公司;96 孔板(货号:F600418)购自上海生工生物工程有限公司;RNA 提取试剂盒(货号:DP431)购自北京天根生化科技有限公司;逆转录试剂盒(货号:QP056)购自美国 Genecopoeia 公司;miR-30b、U6 引物以及 miR-30b 模拟物(miR-30b mimics)、miR-30b 模拟物阴性对照(miR-30b mimics NC)、miR-30b 抑制物(miR-30b inhibitor)、miR-30b抑制物阴性对照(miR-30b inhibitor NC)均由上海生工生物科技有限公司合成;蛋白 marker(货号:B2787-1VL)、β-actin 鼠抗(货号:AB1970-100UL)和PVDF 膜(货号:3010040001)均购自美国 Sigma公司;AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(货号:LHK601-020)购自嘉美生物技术有限公司;Lipofectamine 3000 转染试剂盒(货号:L3000015)购自美国 Invitrogen 公司; 单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)荧光检测试剂盒(货号:KFS305)购自北京百奥莱博科技有限公司;Beclin1 兔多克隆抗体(货号:ab62557)、p62 兔单克隆抗体(货号:ab211324)、LC3-II 和 LC3-I 兔单克隆抗体(货号:ab221794)以及辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 二抗(货号:ab150077)均购自美国Abcam公司;酶标仪Fax-20100 购自美国INStat 公司;尼康SMZ745 光学显微镜购自于上海普赫生物科技有限公司;FACSCanto 流式细胞仪购自美国Beckman 公司;徕卡倒置荧光显微镜DMILLED 购自上海成贯仪器有限公司; 全能型凝胶成像分析系统ChemiDoc-MP 购自山东三瑞科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

分别将各个细胞株接种于含10%胎牛血清的RPIM-1640 培养基中,放于37℃,5% CO2培养箱中培养,每2~3 d 用0.25%胰蛋白酶消化传代,使细胞呈单层贴壁生长。

1.3.2 qRT-PCR 检测正常子宫内膜细胞和子宫内膜癌细胞中miR-30b 表达水平

使用RNA 提取试剂盒分别提取正常子宫内膜细胞和子宫内膜癌细胞HEC-1-A、HEC-1-B、RL95-2 细胞株的总 RNA,逆转录试剂盒逆转录得到cDNA,以cDNA 为模板,按照qRT-PCR 试剂盒说明书配置 PCR 反应体系:2×SYBR mix 10 μL,H2O 8 μL,上下游引物各 0.5 μL,10×cDNA 模板 1 μL。 反应条件设定为:94℃预变性5 min、94℃变性15 s、55℃退火 50 s、35 个循环、72℃延伸 10 min。 以 U6为内参,根据 2-ΔΔCt算法,计算 miR-30b 表达水平。miR-30b 和U6 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3.3 细胞转染与分组

HEC-1-B 癌细胞随机分为HEC-1-B 癌细胞组(正常培养,未转染)、miR-30b inhibitor NC 组(正常培养,转染miR-30b inhibitor NC)、miR-30b inhibitor(正常培养,转染 miR-30b inhibitor)以及 AE 组(含终浓度为 30 μmol/L AE 培养[9],未转染)、AE+miR-30b mimics NC 组(含终浓度为 30 μmol/L AE 培养,转染 miR-30b mimics NC)、AE+miR-30b mimics 组(含终浓度为 30 μmol/L AE 培养,转染 miR-30b mimics),当HEC-1-B 癌细胞生长密度达50%~60%时,使用Lipofectamine 3000 转染试剂盒转染细胞后分别进行正常培养或使用含终浓度为30 μmol/L AE 培养,各组细胞继续培养 24 h 后,检测各项指标。

1.3.4 CCK-8 法检测各组细胞增殖活性

收集各组细胞,调整细胞浓度为每毫升1×105个,每孔接种100 μL 至96 孔板中,空白孔加入100 μL 培养基,在37℃恒温培养箱中培养24 h 使细胞贴壁,加入浓度为10%的CCK-8 溶液,继续培养2 h后,于酶标仪上检测各孔在450 nm 波长下的OD值。 每组各设6 个复孔。 细胞增殖率(%)= (实验组OD450nm-空白组OD450nm)/(对照组OD450nm-空白组OD450nm)。

1.3.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

收集转染或培养24 h 后的各组细胞,1200 r/min 离心 5 min,弃上清,用 PBS 洗涤细胞2 次,加入400 μL 结合缓冲液悬浮细胞,再加入5 μL Annexin V 染液,轻轻混匀后于2℃~8℃下避光孵育15 min,然后加入10 μL PI 轻轻混匀,再次于2℃~8℃避光孵育5 min,上流式细胞仪检测细胞凋亡率,每组重复6 次。

1.3.6 MDC 试剂盒检测各组细胞自噬率

取转染或培养24 h 后的各组细胞,每组设置6个复孔重复,每孔取2 mL 细胞悬液,800 r/min 离心5 min,弃上清,1×Wash buffer 清洗细胞 1 次并重悬细胞,调整浓度为每毫升1×105个,各取90 μL 细胞悬液至新的EP 管中,加入10 μL MDC 染液,轻轻混匀,室温避光孵育30 min,然后800 r/min 离心 5 min,弃上清,1×Wash buffer 清洗细胞 2 次后,加入100 μL collection buffer 重悬细胞滴加于载玻片上,盖上盖玻片,于荧光显微镜下观察(激发波长355 nm,阻断波长512 nm)并计数MDC 阳性细胞(核周和胞浆出现高密度着色点),以MDC 阳性细胞率表示细胞自噬率。

1.3.7 Western blot 法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平

收集转染或培养24 h 后的各组细胞,采用蛋白抽提试剂盒提取各组细胞总蛋白,使用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量,依次进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转 PVDF 膜、5%脱脂奶粉封闭、1 ∶2000浓度稀释后的 Beclin1、p62、LC3-II 和 LC3-I 一抗4℃过夜孵育、置于含辣根过氧化物酶缀合的二抗(1 ∶5000)中室温孵育 2 h、洗膜,用 ECL 试剂盒显色,全能型凝胶成像分析系统拍照,以β-actin 为内参,分析各组蛋白表达水平。

1.4 统计学方法

本研究所得数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析,计量资料以平均数±标准差()表示,使用GraphPad Prism7.0 软件绘制条形图,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验;当P<0.05 时,代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-30b 在正常子宫内膜细胞和不同子宫内膜癌细胞株中的表达

与人正常子宫内膜上皮细胞(1.00±0.00)相比,HEC-1-A、HEC-1-B 和 RL95-2 癌细胞中 miR-30b表达水平分别为(1.87±0.19)、(2.14±0.22)、(1.69±0.17)均显著升高(P< 0.05)。 其中 HEC-1-B 癌细胞中miR-30b 表达水平最高,所以后续将选择HEC-1-B 癌细胞进行转染实验。

2.2 抑制miR-30b 对HEC-1-B 癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响

与HEC-1-B 癌细胞组和miR-30b inhibitor NC组相比,miR-30b inhibitor 组癌细胞miR-30b 表达水平、细胞增殖率以及p62 蛋白表达水平显著降低(P< 0.05),细胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值显著升高(P< 0.05)。 见图 1、图 2。

图1 各组癌细胞增殖、凋亡及自噬比较Note. A, Apoptosis detection chart. B, Autophagy body fluorescence diagram. C, Western blot analysis of autophagy related proteins.Figure 1 Comparison of proliferation, apoptosis and autophagy of cancer cells in each group

图2 各组HEC-1-B 癌细胞增殖凋亡及自噬比较Note. A, Expression level of miR-30b and autophagy related proteins. B, Proliferation, apoptosis and MDC positive cell rate. Compared with HEC-1-B cancer cell group, #P < 0.05. Compared with miR-30b inhibitor NC group, △P < 0.05.Figure 2 Comparison of proliferation, apoptosis and autophagy of HEC-1-B cancer cells in each group

2.3 AE 对 HEC-1-B 癌细胞 miR-30b 表达水平的影响

与 HEC-1-B 癌细胞组(1.00±0.00)相比,AE 组(0.32±0.04)和 AE+miR-30b mimics NC 组(0.35±0.05)癌细胞中miR-30b 表达水平显著降低(P<0.05);与 AE+miR-30b mimics NC 组相比,AE+miR-30b mimics 组(1.17±0.12)癌细胞中 miR-30b 表达水平显著升高(n=6,P< 0.05)。

2.4 AE 对 HEC-1-B 癌细胞增殖活性和凋亡的影响

与HEC-1-B 癌细胞组相比,AE 组和AE+miR-30b mimics NC 组癌细胞增殖率显著降低,细胞凋亡率显著升高(P< 0.05);与AE+miR-30b mimics NC组相比,AE+miR-30b mimics 组癌细胞增殖率显著升高,细胞凋亡率显著降低(P< 0.05)。 见图3、图4。

图3 各组细胞凋亡情况检测结果Note. A, HEC-1-B cancer cell group. B, AE group. C, AE+miR-30b mimics NC group. D, AE+miR-30b mimics group.Figure 3 Detection results of apoptosis in each group.

图4 各组HEC-1-B 癌细胞增殖率和凋亡率比较Note. Compared with HEC-1-B cancer cell group, #P < 0.05.Compared with AE+miR-30b mimics NC group, △P < 0.05.Figure 4 The ratio of proliferation rate and apoptosis rate of HEC-1-B cancer cells in each group

2.5 AE 对HEC-1-B 癌细胞自噬率的影响

与HEC-1-B 癌细胞组(2.26±0.29)%相比,AE组(24.57±2.51)%和 AE+miR-30b mimics NC 组(29.22±3.20)%癌细胞自噬率显著升高(P<0.05);与 AE+miR-30b mimics NC 组相比,AE+miR-30b mimics 组(15.19±1.71)%癌细胞自噬率显著降低(P< 0.05)。 见图 5。

图5 各组HEC-1-B 癌细胞自噬小体荧光图Note. A, HEC-1-B cancer cell group. B, AE group. C, AE+miR-30b mimics NC group. D, AE+miR-30b mimics group.Figure 5 Fluorescence of autophagy bodies of HEC-1-B cancer cells in each group

2.6 AE 对HEC-1-B 癌细胞自噬相关蛋白表达水平的影响

与HEC-1-B 癌细胞组相比,AE 组和AE+miR-30b mimics NC 组癌细胞 Beclin1 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值显著升高,p62 蛋白表达水平显著降低(P< 0.05)。 与 AE+miR-30b mimics NC 组相比,AE+miR-30b mimics 组癌细胞Beclin1 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值显著降低,p62 蛋白表达水平显著升高(P< 0.05)。 见图 6、图 7。

图6 各组HEC-1-B 癌细胞自噬相关蛋白表达Western blot 图Note. A,HEC-1-B cancer cell group. B,AE group. C,AE+miR-30b mimics NC group. D, AE+miR-30b mimics group.Figure 6 Expression of autophagy related proteins in HEC-1-B cancer cells of each group by Western blot

图7 各组HEC-1-B 癌细胞中Beclin1、p62 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值比较Note. Compared with HEC-1-B cancer cell group, #P < 0.05.Compared with AE+miR-30b mimics NC group, △P < 0.05.Figure 7 Comparison of Beclin1 and p62 protein expression levels and LC3-II/I ratio in HEC-1-B cancer cells of each group

3 讨论

子宫内膜癌好发于围绝经期与绝经后妇女,目前早期患者的5 年生存率可达80%~90%,但晚期患者预后较差,5 年生存率仅为5%,确切病因仍不清楚,临床观察发现可能与雌激素对子宫内膜的长期持续刺激有关,还可能与子宫内膜增生、不育、晚绝经、家族史等有关[10],其发病机制也较为复杂。因此探究子宫内膜癌具体发病机制对其后期治疗至关重要。 本研究发现,与正常子宫内膜上皮细胞相比,不同子宫内膜癌细胞株HEC-1-A、HEC-1-B 和RL95-2 中 miR-30b 表达水平均显著升高,其中HEC-1-B 癌细胞中miR-30b 表达水平最高。

AE 为大黄中有效抗菌成分,在多种人类癌细胞系中具有抗癌特性,包括抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞周期阻滞和细胞死亡,调节免疫信号等[11]。 除本身具有的抗肿瘤作用外,还可提高肿瘤对放疗、化疗的敏感性[12]。 另外刘豪杰等[13]研究发现,AE 可通过提高胃癌细胞自噬,诱导细胞凋亡,Gao 等[14]研究发现AE 可诱导宫颈癌细胞凋亡。 而诱导癌细胞自噬和凋亡可发挥抗子宫内膜癌的作用[15]。 其中自噬蛋白Beclin1 表达水平及LC3-II/I 比值可用于反映自噬程度,而自噬溶酶体降解底物p62 表达的增加与自噬水平呈反相关[16]。本研究发现,AE 可显著降低 HEC-1-B 癌细胞中miR-30b 表达水平、细胞增殖率以及p62 蛋白表达水平,显著提高细胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值,提示AE 可能通过促进HEC-1-B 癌细胞自噬,进一步促进其凋亡,抑制其增殖,但是否调控miR-30b 尚需进一步研究。Li 等[17]研究发现miR-30b 可通过抑制自噬减轻肝缺血再灌注损伤。 miR-30b 还通过抑制耐顺铂胃癌细胞的自噬来消除肺腺癌转移相关转录本1 诱导的顺铂耐药性[18]。 本研究发现,抑制miR-30b 可显著降低HEC-1-B 癌细胞中miR-30b 表达水平、细胞增殖率、以及p62 蛋白表达水平,显著提高细胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值,提示抑制miR-30b 可能通过促进HEC-1-B 癌细胞自噬,进一步促进其凋亡。 而Bai 等[19]研究发现AE 不但可通过抑制miR-1 来缓解高脂饮食诱导的大鼠心电图中Q 波和T 波时间延长,还可通过上调miR-15a,从而抑制凋亡相关基因Bcl-2 表达,诱导乳腺肿瘤细胞凋亡[20]。 本研究为进一步探究AE调控miR-30b 对HEC-1-B 癌细胞的影响,将HEC-1-B 癌细胞转染 miR-30b mimics 后,使用 AE 处理,发现与AE+miR-30b mimics NC 组相比,AE+miR-30b mimics 组癌细胞miR-30b 表达水平、细胞增殖率以及p62 蛋白表达水平显著升高,而细胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表达水平和LC3-II/I 比值显著降低,提示上调miR-30b 可逆转AE 对癌细胞发挥的作用。

综上所述,AE 可能通过抑制miR-30b 表达,促进HEC-1-B 癌细胞自噬,进一步抑制癌细胞增殖,促进其凋亡,而上调miR-30b 可逆转AE 对HEC-1-B 癌细胞的作用。 然而AE 对子宫内膜癌的作用机制较为复杂,尚需深入研究。